一种油菜BnMAN7基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种油菜

【技术实现步骤摘要】
一种油菜BnMAN7基因及其应用
本专利技术涉及一种油菜BnMAN7基因及其应用，属于植物基因工程和生物

技术介绍
甘蓝型油菜籽粒产量高，在我国主要被种植在长江中下游地区，是我国种植最广泛的油料作物之一，约占世界产量的20%。但由于我国油菜生产机械化程度不高且生产成本高，无法满足国内的消费需求，仍有大量油料消耗依赖进口。因此，提高油菜生产效率，增加油菜产量、是我国油菜研究的重要目标。角果开裂会使收获前大量的种子脱落，从而导致产量的大量减产，同时脱落的种子产生大量的自生苗，在水、肥、气、热等条件适合时，往往先于当年播种油菜出苗，争夺空间和消耗土壤中的养分，并且易裂的角果不利于机械化收获。与其他作物相比，油菜角果易开裂，开裂引起产量的损失达20%左右，在不利的气候条件下产量损失甚至可达50%。角果开裂不仅引起产量的损失，也不利于油菜的机械收割。甘蓝型油菜抗裂荚特性变异不大，目前还没有抗裂荚的品种，其他近缘种中虽然存在抗裂荚特性，但种间杂交很难除去不良农艺性状的影响。纤维素酶和半纤维素酶是一类水解酶，参与植物中与脱落和开裂相关的过程。植物中纤维素酶具有许多与发育过程相关的组织特异性表达模式，如组织扩张、果实成熟或器官脱落；半纤维素酶主要包含木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等酶，可以把半纤维素分解为小分子多糖或者单糖。目前，国内外在油菜抗裂角方面的研究较少，亟需寻找油菜中参与角果开裂的相关基因，为了解决这些问题，寻找调节控制油菜角果开裂相关的基因并对其功能进行研究，是培育机械化收获品种的基础，也是分子育种的主要目标。
技术实现思路
本专利技术旨解决上述技术问题之一，为此，本专利技术提出了一种油菜BnMAN7基因及其应用。本专利技术首先提供一种油菜BnMAN7基因在增强油菜角果抗裂性中的应用，所述油菜BnMAN7基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述油菜BnMAN7基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。具体的，通过对BnMAN7基因的沉默或抑制表达提高油菜角果的抗裂性，具体的通过对BnMAN7基因的特异性序列片段（其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示）沉默或抑制表达提高油菜角果的抗裂性。本专利技术提供一种重组表达载体，所述重组载体含有BnMAN7基因中的一段特异性序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；所述重组载体的具体制备方法为：将BnMAN7上的这段特异性序列克隆进入门载体BnMAN7-pENTR，再将入门载体BnMAN7-pENTR和目的载体pHellsgate12及Gateway™LRClonase™酶混合，最终得到BnMAN7抑制重组表达载体pHellsgate12-BnMAN7。本专利技术还提供所述重组载体在提高油菜角果抗裂性的用途。本专利技术还提供一种转化子，所述转化子为重组载体pHellsgate12-BnMAN7转化宿主菌获得；所述宿主菌为农杆菌GV3101。本专利技术还提供一种提高油菜角果抗裂性的方法，具体的，包括：将所述的油菜BnMAN7基因连接到表达载体中，构建得到重组表达载体；将所述的重组载体转化微生物培养表达，然后将得到的转化子采用下胚轴转化法浸染油菜；所述微生物为农杆菌GV3101。本专利技术的优点是：（1）本专利技术中所采用的基因为油菜cDNA文库中克隆得到，本专利技术的方法对得到目的基因可靠性高、速度快、效率高。（2）本专利技术采用农杆菌介导的下胚轴转化法来转化油菜，农杆菌作为天然的载体系统，成功率高，且该系统机理研究最清楚。本专利技术中，选用的下胚轴再生能力强，易被农杆菌侵染，该方法转化效率高，速度快。（3）本专利技术中克隆得到的油菜角果抗裂性相关基因BnMAN7，抑制该基因的表达可增强角果抗裂性，为进一步培育角果抗裂性的油菜新品种提供新的育种材料。（4）本专利技术涉及的基因BnMAN7在提高角果抗裂性中的用途，对油菜、大豆等角果易裂的植物生产育种等具有重要指导借鉴意义。本专利技术构建的pHellsgate12-BnMAN7重组载体转化油菜获得的BnMAN7抑制表达株系，为研究BnMAN7基因在油菜角果抗裂性研究提供了原材料，为作物角果抗裂性育种提供理论指导，将有助于培育易于机械化收获、高产的新品种。附图说明图1为BnMAN7蛋白的保守结构域特征。图2为BnMAN7与其他物种同源蛋白氨基酸序列比对结果，其中A为甘蓝型油菜的蛋白序列、B为白菜型油菜的蛋白序列、C为萝卜的蛋白序列、D为钻果大蒜芥的蛋白序列、E为拟南芥的蛋白序列、F为基因BnMAN7的蛋白序列；图中黑色区域显示的为相同的氨基酸，灰色区域显示的为类似的氨基酸。图3为BnMAN7基因组织表达模式分析结果。图4为植物转化重组表达载体pHellsgate12-BnMAN7的T-DNA插入区结构示意图。图5为油菜BnMAN7基因抑制表达株系PCR鉴定结果，M为DL2000DNAMarker，+为阳性对照；#1、#2、#3、#4为独立的转化株系，H2O为空白对照，WT为阴性对照。图6为qPCR检测基因抑制表达株系与野生型株系中BnMAN7表达水平的比较；WT为野生型对照；#1、#2、#3、#4为独立的转化株系。图7为BnMAN7原核表达载体pGEX-4T-1-BnMAN7示意图。图8为BnMAN7半纤维素酶活性的检测结果。图9为野生型与BnMAN7阳性转化植株角果拉裂力检测结果，#2和#3为BnMAN7阳性转化植株。具体实施方式结合附图和以下实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但所述的实施例是为了更好的解释本专利技术，而不是对本专利技术的限制。本专利技术中所涉及试剂或材料，如未有特殊说明，均为常规购买得到。实施例1.BnMAN7基因的获得根据拟南芥半纤维素酶基因MANNANASE7的信息（核苷酸序如SEQIDNO.20所示，GENEBANK数据库登录号为：BT008749.1，氨基酸序列SEQIDNO.21所示，GENEBANK数据库登录号为：AAP49511.1），在数据库中对油菜基因筛选，最终确认以BnaA07g12590D（核苷酸序如SEQIDNO.1所示）作为研究对象，进一步从甘蓝型油菜中双11号（种子购于武汉中油种业科技有限公司）中克隆此基因并研究其功能，将克隆到的基因命名为BnMAN7，具体步骤如下：（1）植物材料培养：以甘蓝型油菜中双11号植株（种子购于武汉中油种业科技有限公司，由本实验室种植）作为实验材料，生长条件为：温度为20+2℃；湿度为60-90%；每天光周期为光照8h黑暗16h；光照强度为44µmolm-2s-1。（2）油菜总RNA的提取以及cDNA合成：Trizol试剂快速提取法提取油菜总RNA：取少量样品在研钵中用液氮冷冻后快速研磨成粉状，加至含有1mLTrizol的冰上预冷的1.5mL的EP管中，充分震荡混匀后，4℃，12,000rpm离心10min；取约800μL上清于新本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.油菜

【技术特征摘要】
1.油菜BnMAN7基因在增强油菜角果抗裂性中的应用，所述油菜BnMAN7基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述油菜BnMAN7基因的一段特异性序列，在增强油菜角果抗裂性中的应用，所述特异性序列的如SEQIDNO.9所示。


3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于，通过沉默/抑制如SEQIDNO.9所示BnMAN7基因特异性片段的表达达到增强油菜角果抗裂角性。


4.一种重组表达载体，所述重组表达载体含有权利要求1所述油菜BnMAN7基因的一段特异性序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。


5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭小力，禹艳坤，王伟杰，王政，朱克明，李玉龙，杨艳华，丁丽娜，曹军，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32