一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法。组分I+III沉淀溶解后，加辛酸沉淀脂质蛋白，辛酸沉淀后的上清再用A50凝胶吸附样品中的凝血因子类及铜蓝蛋白等杂蛋白后，再进行一步离子交换层析，超滤配制，纳米膜除病毒分装。本发明专利技术是从组分FI+III废弃组分沉淀中提取IgG，大大提高了血浆的综合利用率，本发明专利技术在辛酸沉淀脂蛋白，纤维蛋白原等一部分杂蛋白后，增加一步A50凝胶提前吸附各类凝血因子，避免了产品中各类凝血因子在后续层析步骤中被激活，增加了工艺的可控性和顺畅性，并且产品获得较高的收率和纯度。

【技术实现步骤摘要】
一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法
本专利技术涉及血液制品
，特别是涉及一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法。
技术介绍
静注人免疫球蛋白(pH4，以下简称IVIG)是从健康人血浆中分离提取得到的免疫球蛋白。IVIG具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用，临床使用广泛，在原发性或获得性免疫球蛋白缺陷症、细菌感染、病毒感染、血液系统疾病、川崎病等的治疗中有显著的效果。目前，静注人免疫球蛋白的分离方法基本都采用低温乙醇工艺。1940s，美国哈佛大学的E.J.Cohn教授专利技术了低温乙醇分离血浆蛋白的工艺，其是通过系统地改变低温乙醇的五变因素，pH值，温度，乙醇浓度，离子强度，蛋白质浓度，这五个因素相互作用，影响不同类蛋白质的溶解度，逐级沉淀血浆中的不同蛋白质。一般分离人免疫球蛋白的步骤为先从I+II+III组分或II+III组分中分离组分II，组分II经过纯化得到人免疫球蛋白，提取人免疫球蛋白后会产生组分I+III沉淀或产生组分III沉淀，被作为废弃物处理。由于纯化工艺中影响因素很多，组分I+III沉淀或组分III沉淀中10-20％左右的IgG未被有效分离出来。鉴于血浆资源异常宝贵，为充分利用血浆资源，有研究者开发出从I+III沉淀或者组分III沉淀中提取IgG的工艺，例如专利技术专利(公开号CN101648998A)公开了一种从组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ中制备静注人免疫球蛋白的方法，其采用三次低温乙醇法从组分Ⅰ+Ⅲ中提纯人免疫球蛋白，步骤繁多，操作环境需要低温，能耗高，乙醇溶剂易燃易爆等诸多缺陷，乙醇对IgG的结构和功能都有一定的影响，并且只有一步病毒灭活方法，不能保证产品的安全性。又例如专利技术专利(公开号CN102250240A)公开了一种从血浆分离组分Ⅰ+Ⅲ中制备静注人免疫球蛋白的方法，先用辛酸沉淀杂蛋白，然后一步离子交换层析，最后两种不同孔径纳滤膜串联过滤除病毒后，进行超滤配制无菌分装。虽然该工艺在一定程度上保证了产品的质量，降低能耗，但是该工艺只有一步阴离子交换层析，并且是流穿法，凝胶需要吸附样品中60％的杂质，这就注定需要大量凝胶，需要装填大规模层析柱，增加了生产成本和操作的复杂性，并且由于样品杂质成分很多，主要是有各种容易被激活的凝血因子或已经活化的凝血因子，因此上层析柱前样品极不稳定，很容易产生蛋白质沉淀，堵塞层析柱，样品上柱压力大，这样增加了生产工艺的复杂性，并且最终产品中活化的凝血因子含量较高不能保证产品质量。在病毒灭活方面，该专利采用的是辛酸加两种不同孔径纳滤膜串联过滤除病毒，虽是两种机制的病毒灭活方法，但是两种不同孔径纳滤膜串联，由于样品蛋白浓度高，导致样品过滤压力大，过滤时间很长，增加了制品被污染的风险。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述存在的缺陷而提供一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法。本专利技术是从废弃组分FI+III沉淀中提取IgG，组分I+III沉淀溶解后，加辛酸沉淀脂质蛋白，用A50凝胶吸附样品中的凝血因子类和铜蓝蛋白等杂蛋白后后，再进行一步离子交换层析，超滤配制，纳米膜除病毒分装。大大提高了血浆的综合利用率，同时，本专利技术在辛酸沉淀脂蛋白，纤维蛋白原等一部分杂蛋白后，增加一步A50凝胶提前吸附各类凝血因子，避免了产品中各类凝血因子在后续层析步骤中被激活，增加了工艺的可控性和顺畅性，并且产品获得较高的收率和纯度。本专利技术的一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法技术方案为，包括以下步骤：(1)组分FI+III沉淀溶解；(2)辛酸沉淀杂蛋白；(3)A50凝胶吸附；(4)过滤；(5)离子交换层析；(6)超滤配制；(7)病毒灭活和分装。所述的步骤(1)具体为：沉淀溶解液为10-20mmol/L磷酸盐缓冲液，用醋酸调节pH值至4.0-5.0，投入FI+III沉淀后，溶解倍数为5-10倍，溶解时间为2-3h，溶解温度为20±5℃，得到溶解液。所述的步骤(2)具体为：向溶解液中加入20-140mmol/L辛酸，加辛酸速度为100ml/min，加完辛酸后，在20±5℃继续搅拌1-2h，压滤或离心得上清溶液。所述的步骤(3)具体为：向压滤或者离心后上清溶液中加入平衡好的DEAESephadexA50凝胶，搅拌转速80-100r/min，搅拌吸附40-60分钟。DEAESephadexA50凝胶平衡方法为：将含10-30mmol/L磷酸氢二钠、30-80mmol/L氯化钠、pH为5.0-6.0的平衡液加入溶胀好的凝胶中，搅拌均匀并平衡10-20分钟，抽滤除去平衡液，再添加新的平衡液，反复平衡3-5次。所述的步骤(4)具体为：通过隔膜泵将料液经过筛网过滤去除A50凝胶，凝血因子及铜蓝蛋白等其它杂蛋白吸附在A50凝胶上。所述的步骤(5)具体为：过滤后的溶液通过平衡好的层析柱，上样流速为700-900ml/min，IgG流穿出层析柱，杂质吸附在TMAE凝胶柱上，用洗脱液洗脱被吸附在柱子上的杂质蛋白；平衡液：15mmol/L磷酸氢二钠，用冰醋酸调节pH值至5.0-6.0；洗脱液：10-20mmol/L磷酸氢二钠，2mol/L氯化钠。所述的步骤(6)具体为：层析得到的溶液用纯化水恒体积透析，超滤至蛋白浓度为50-60/L；加入0.2-0.5mol/L甘氨酸作为稳定剂，配制得到蛋白浓度为50±5g/L。所述的步骤(7)具体为：用20nm的纳米膜过滤去除病毒，然后进行无菌分装。组分FI+III沉淀来源为：从检测合格的人血浆中用乙醇分离出FI+II+III沉淀，FI+II+III沉淀溶解后，加入乙醇浓度为14％，调节pH为5.2±0.5，温度为-4±1℃，加入硅藻土和珍珠岩，压滤出FI+III沉淀。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术是从组分FI+III废弃组分沉淀中提取IgG，大大提高了血浆的综合利用率。2、本专利技术在辛酸沉淀脂蛋白，纤维蛋白原等一部分杂蛋白后，增加一步A50凝胶吸附各类凝血因子和铜蓝蛋白，避免了后续纯化步骤中产品中各类凝血因子的活化，增加了工艺的可控性和顺畅性，并且产品获得较高的收率和纯度，降低了产品的凝血风险。3、增加一步A50凝胶吸附各类凝血因子，提高了样品的纯度，减轻了后一步离子交换的压力，提高了TMAE凝胶每ml凝胶可处理的杂质载量，并且由于A50凝胶价格便宜，节省了生产成本。4、本专利技术工艺步骤中采用辛酸沉淀法粗制IgG，辛酸不仅能够沉淀杂蛋白和脂类，而且能够灭活脂包膜病毒；同时工艺中采用20nm纳米膜过滤去除脂包膜和非脂包膜病毒，两种不同机制的病毒灭活/去除步骤，能最大程度灭活去除病毒污染，最大程度的保证制品的安全性。5、20nm纳滤膜过滤后直接进行分装，减少了除菌步骤，使工艺连接更加顺畅，节省了人力和物力，简化了步骤，缩短了生产周期。具体实施方式：为了更好地理解本专利技术，下面用具体实例来详细说明本专利技术的技术方案，但是本专利技术并不局限于此本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)组分FI+III沉淀溶解；/n(2)辛酸沉淀杂蛋白；/n(3)A50凝胶吸附；/n(4)过滤；/n(5)离子交换层析；/n(6)超滤配制；/n(7)病毒灭活和分装。/n

【技术特征摘要】
1.一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)组分FI+III沉淀溶解；
(2)辛酸沉淀杂蛋白；
(3)A50凝胶吸附；
(4)过滤；
(5)离子交换层析；
(6)超滤配制；
(7)病毒灭活和分装。


2.根据权利要求1所述的一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤(1)具体为：沉淀溶解液为10-20mmol/L磷酸盐缓冲液，用醋酸调节pH值至4.0-5.0，投入FI+III沉淀后，溶解倍数为5-10倍，溶解时间为2-3h，溶解温度为20±5℃，得到溶解液。


3.根据权利要求2所述的一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤(2)具体为：向溶解液中加入20-140mmol/L辛酸，加辛酸速度为100ml/min，加完辛酸后，在20±5℃继续搅拌1-2h，压滤或离心得上清溶液。


4.根据权利要求3所述的一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤(3)具体为：向压滤或者离心后上清溶液中加入平衡好的DEAESephadexA50凝胶，搅拌转速80-100r/min，搅拌吸附40-60分钟。


5.根据权利要求4所述的一种从血浆组分FI+III沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于，DEAESephadexA50凝胶平衡方法为：将含10-30mmol/L磷酸氢二钠、30-80mmol/L氯化钠、pH为5.0-6.0的平衡液加入溶胀好的凝胶中，搅拌均匀并平衡10-20分钟，抽滤除去...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋佃卫，陈晨，菅长永，马山，
申请(专利权)人：山东泰邦生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37