一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测抗凝血杀鼠剂的ELISA方法及其试剂盒，由酶标板（包被式I华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物）、抗体工作液（含华法林药物单克隆抗体）、酶标记物工作液（含辣根过氧化物酶标记的抗华法林药物单克隆抗体的抗抗体）、洗涤液、样品稀释液、样品提取液、含不同梯度浓度华法林标准品溶液、底物显色液、终止液组成。本发明专利技术所提供的检测试剂盒可用于食品中毒物和人血清的检测，检测猪肉、牛奶、血清中华法林检测限为5.0µg/kg，溴敌隆、氯灭鼠灵检测限为15.0µg/kg，杀鼠醚、氯敌鼠检测限为20.0µg/kg，批间变异系数小于10%、批内变异系数小于15%，具有操作简单、快速，灵敏度高、特异性强、准确性强的优点，对于食物中毒的快速检测具有重大价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用
本专利技术属于药物残留快速检测领域，涉及一种检测抗凝血杀鼠剂的试剂盒及其制备方法与应用。
技术介绍
华法林、溴敌隆、氯灭鼠灵、杀鼠醚、氯敌鼠是我国常用的几种抗凝血杀鼠剂，它们通过竞争性地抑制维生素K的作用，抑制肝脏产生凝血酶原及凝血因子，提高毛细血管通透性和脆性，造成鼠内出血死亡。随着此类灭鼠剂的大量施用，鼠药不可避免地残留在食物中，影响人类健康。近年来，此类灭鼠剂造成中毒的事件时有发生，严重危害人民身体健康与生命安全。目前检测上述抗凝血杀鼠剂的检测方法主要有高效液相法和液相色谱质联用法，这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。而快速检测方法主要是化学法比色检测方法，特异性、灵敏度差，易发生误判，不能满足现场检测需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗凝血杀鼠剂酶联免疫检测试剂盒，并提供一种灵敏度高、特异性强、检测成本低、适于大批量样品筛选的检测方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，由酶标板、标准品工作液、抗体工作液、酶标记物工作液、样品稀释液、样品提取液、洗涤液、底物显色液、终止液组成。所述酶标板由华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被制成。所述华法林半抗原是华法林和羧甲基羟胺盐酸盐反应得到的，具体制备方法如下：称取53mg华法林用9.0mL吡啶溶解，加入25.9mg羧甲基羟胺盐酸盐反应，加热到40℃搅拌，TLC检测反应完全后用氮气吹干吡啶，即得式I所述化合物。式I所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、鼠血清蛋白（MSA）、甲状腺蛋白（BCG）、兔血清蛋白（RSA）、血蓝蛋白（KLH）或卵清白蛋白（OVA）。所述华法林半抗原与载体蛋白的偶联物是指华法林半抗原与载体蛋白通过活性酯法得到的产物，具体包括如下步骤：1）将所述华法林半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述华法林半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为29.4mg：1.5mL：38.3mg：23.0mg；2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5mL；3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；4）用PBS缓冲液（0.01MPBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述华法林包被原。所述华法林抗体为华法林药物的特异性抗体。所述华法林抗体工作液为将华法林的单克隆抗体用抗体稀释液稀释1000倍，获得含有华法林药物的单克隆抗体的抗体工作液。所述抗体稀释液为含有Proclin300、TritonX-100的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、Proclin300和TritonX-100，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072g/L、0.59g/L、8.5g/L、0.4g/L、200μL/L和500μL/L。所述酶标记物工作液为将辣根过氧化物酶标记的抗华法林药物单克隆抗体的抗抗体用抗抗体稀释液稀释500倍获得的。所述抗抗体稀释液为含有小牛血清、Proclin300的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、小牛血清和Proclin300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072g/L、0.6g/L、16g/L、0.4g/L、50mL/L和200μL/L。在所述试剂盒中，所述华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被于酶标板上。在所述试剂盒中，所述华法林药物的特异性抗体为所述华法林单克隆抗体。在所述试剂盒中，所述华法林单克隆抗体由重链和轻链组成。所述重链的可变区的氨基酸序列可如序列表的序列1所示。所述轻链的可变区的氨基酸序列可如序列表的序列2所示。在所述试剂盒中，所述6种标准品工作液的溶剂为含有光稳定剂、牛血清白蛋白的PBS缓冲液，溶质为华法林；所述溶质在所述6种标准品工作液中的浓度分别为0μg/L、0.15μg/L，0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L、12.15μg/L；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂和牛血清白蛋白，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68g/L、0.1g/L、4g/L、0.1g/L、0.2g/L和0.1g/L，pH值为7.2。在所述试剂盒中，所述样品稀释液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68g/L、0.1g/L、4g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.1g/L和0.1g/L，pH值为7.2。在所述试剂盒中，所述样品提取液为含有光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、光稳定剂、牛血清白蛋白和表面活性剂，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为2.68g/L、0.1g/L、4g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.1g/L和0.2g/L，pH值为7.2。在所述试剂盒中，所述洗涤液为含有吐温20和Proclin300的PBS缓冲液；所述洗涤液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、吐温-20和Proclin300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为23.2g/L、2.0g/L、64g/L、0.036g/L、20mL/L和300μL/L。在所述试剂盒中，所述底物显色液为1.0g/L过氧化脲、5.0g/L乙酸钠、0.5g/L光稳定剂、2.5mL/L磷酸、5.0g/L四甲基联苯胺的混合水溶液，溶剂为去离子水。在所述试剂盒中，所述终止液为0.05mol/L的硫酸水溶液。本专利技术的另一个目的是提供一种检测样品中华法林的方法，包括如下步骤：1）对样品进行前处理获得所述样品的溶液；2）用上述任一所述试剂盒进行检测；3）分析检测结果。在上述方法中，所述用试剂盒进行检测包括如下步骤：向包被有所述华法林本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，包括：华法林检测酶标板、华法林系列标准品工作液、华法林抗体工作液、酶标记物工作液、样品稀释液、样品提取液、洗涤液、底物显色液、终止液组成，其特征在于：所述华法林酶标板由式I所示华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被制成：/n

【技术特征摘要】
1.一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，包括：华法林检测酶标板、华法林系列标准品工作液、华法林抗体工作液、酶标记物工作液、样品稀释液、样品提取液、洗涤液、底物显色液、终止液组成，其特征在于：所述华法林酶标板由式I所示华法林药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被制成：



式I
所述华法林抗体为华法林药物的特异性抗体。


2.根据权利要求1所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述华法林半抗原的制备方法包括如下步骤：称取53mg华法林用9.0mL吡啶溶解，加入25.9mg羧甲基羟胺盐酸盐反应，加热到40℃搅拌，TLC检测反应完全后用氮气吹干吡啶，即得式I所述化合物。


3.根据权利要求1所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述华法林药物的特异性抗体为所述华法林单克隆抗体，所述华法林单克隆抗体由重链和轻链组成，所述重链的可变区的氨基酸序列可如序列表的序列1所示，所述轻链的可变区的氨基酸序列可如序列表的序列2所示。


4.根据权利要求1或3所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述华法林抗体工作液为将华法林的单克隆抗体用抗体稀释液稀释1000倍，获得含有华法林药物的单克隆抗体的抗体工作液；
所述抗体稀释液为含有Proclin300、TritonX-100的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、Proclin300和TritonX-100，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072g/L、0.59g/L、8.5g/L、0.4g/L、200μL/L和500μL/L。


5.根据权利要求1所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标记物工作液为将辣根过氧化物酶标记的抗华法林药物单克隆抗体的抗抗体用抗抗体稀释液稀释500倍获得的；
所述抗抗体稀释液为含有小牛血清、Proclin300的PBS缓冲液；所述抗体稀释液的溶剂为去离子水，溶质为无水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、小牛血清和Proclin300，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为1.072g/L、0.6g/L、16g/L、0.4g/L、50mL/L和200μL/L。


6.根据权利要求1所述的一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述华法林系列标准品工作液为6种华法林标准品工作液，所述溶液的溶剂为含有光稳定剂、牛血清白蛋白的PBS缓冲液，溶质为华法林；所述溶质在所述6种标准品工作液中的浓度分别为0μg/L、0.15μg/L，0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L、12.15μg/L；所述PBS缓冲液的溶剂为去离子水，溶质为十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘河冰，温凯，马立才，丁亚芳，崔乃元，聂靖东，邢维维，刘薇，杨柳，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11