飞蝗V-ATPase-V0结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用制造技术

本发明专利技术公开了飞蝗V‑ATPase‑V0结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用，所述飞蝗V‑ATPase‑V0结构域基因包括飞蝗V‑ATPase‑a、V‑ATPase‑c、V‑ATPase‑c”、V‑ATPase‑d和V‑ATPase‑e基因，具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组数据库中获取V‑ATPase‑V0结构域中各基因，分别对其进行克隆测序后获得各基因全长cDNA序列，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：21所示；基于上述各基因序列，通过PCR方法分别获得V‑ATPase‑a、V‑ATPase‑c、V‑ATPase‑c”、V‑ATPase‑d和V‑ATPase‑e基因片段，由所述基因片段分别合成对应的dsRNA，分别将合成的dsRNA注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，从而使飞蝗生长发育受阻导致死亡，致死率达到74.6％‑96.8％。由于本发明专利技术的特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要意义，可以为害虫防治提供新的途径。

【技术实现步骤摘要】
飞蝗V-ATPase-V0结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用
本专利技术涉及生物技术及农业害虫防治领域，具体涉及飞蝗V-ATPase-V0结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用。
技术介绍
飞蝗Locustamigratoria，是一种洲际性的农业害虫，主要分布于亚、欧、非、澳四大洲。它具有暴发性、群集性和迁飞性的特点，一旦发生，不仅涉及面广，而且来势凶猛，致灾严重。目前在蝗虫防治工作中，仍以化学杀虫剂为主要手段，化学杀虫剂的大量使用，不仅容易导致昆虫产生抗药性，并且给生态环境带来严重污染，对人类的健康也构成威胁，因此研发绿色新型农药对我国防治蝗虫工作具有重要意义。RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默的现象，自2006年获得诺贝尔奖以来，RNAi技术一直跻身于科技前沿。RNAi不仅是研究基因功能的有力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过RNAi进行害虫防治具有如下特点：1)杀虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2)RNA在自然界极易降解，无残留；3)对环境无毒无害，相对安全。目前国际上已将RNAi技术称为第四代杀虫剂核心技术。由美国孟山都公司研发的表达玉米根叶甲Snf7基因dsRNA的RNAi转基因玉米(MON87411)已经获得美国农业部(USDA)和环保署(EPA)批准，即将开展商业化应用。实验表明这种转基因玉米不仅可以有效杀死玉米根甲虫且对蜜蜂等非靶标生物没有明显毒性作用。筛选和鉴定对害虫生长发育至关重要的基因是应用RNAi技术开发新型杀虫剂的关键环节，因为不是所有的dsRNA都能有效的沉默靶基因的表达，也不是所有的dsRNA都能杀死害虫。V-ATPase(Vacuolar-typeATPase)，一种H+通道蛋白，其广泛存在于原核和真核生物的内涵体、溶酶体等多种细胞器膜及某些特殊细胞的质膜上，调节细胞内外环境的pH，对维持生物体正常生命活动至关重要。V-ATPase是一类高度保守的复合酶，由胞外的V1结构域和跨膜的V0结构域组装而成，其中，V1结构域由A、B、C、D、E、F、G、H大亚基组成，负责ATP的水解；V0结构域由a,c,c',c",d,e组成(c'存在于酵母细胞中)，行使质子转运功能。目前未见针对飞蝗V-ATPase-V0结构域基因(V-ATPase-a、V-ATPase-c、V-ATPase-c"、V-ATPase-d、V-ATPase-e)的相关研究。本专利技术首次证实分别注射上述飞蝗V-ATPase-V0结构域基因的dsRNA至3龄若虫后出现74.6％-96.8％致死现象。因此，V-ATPase-V0结构域基因可作为基于RNAi的害虫防治技术的高致死靶标基因。
技术实现思路
针对上述现有技术现状，本专利技术的目的是提供飞蝗V-ATPase-V0结构域基因、基因片段及其dsRNA在致死飞蝗中的应用。本专利技术提供飞蝗V-ATPase-V0结构域基因，包括以下基因：飞蝗V-ATPase-a基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：1，核苷酸长度为2532bp；氨基酸序列为SEQIDNO：2，序列长度为843个氨基酸；飞蝗V-ATPase-c基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：6，核苷酸长度为474bp；氨基酸序列是SEQIDNO：7，序列长度为157个氨基酸；飞蝗V-ATPase-c”基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：11，核苷酸长度为627bp；氨基酸序列是SEQIDNO：12，序列长度为208个氨基酸；飞蝗V-ATPase-d基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：16，核苷酸长度为1047bp；氨基酸序列是SEQIDNO：17，序列长度为348个氨基酸；飞蝗V-ATPase-e基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：21，核苷酸长度为255bp；氨基酸序列是SEQIDNO：22，序列长度为84个氨基酸。本专利技术提供的一种飞蝗V-ATPase-V0结构域基因片段，包括以下基因片段：V-ATPase-a基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：3；V-ATPase-c基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：8；V-ATPase-c”基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：13；V-ATPase-d基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：18；V-ATPase-e基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：23。本专利技术提供的一种飞蝗V-ATPase-V0结构域基因的dsRNA，包括以下dsRNA：由飞蝗V-ATPase-a基因片段SEQIDNO：3合成的dsRNA；由飞蝗V-ATPase-c基因片段SEQIDNO：8合成的dsRNA；由飞蝗V-ATPase-c”基因片段SEQIDNO：13合成的dsRNA；由飞蝗V-ATPase-d基因片段SEQIDNO：18合成的dsRNA；由飞蝗V-ATPase-e基因片段SEQIDNO：23合成的dsRNA。本专利技术提供飞蝗V-ATPase-V0结构域基因dsRNA在害虫防治中的应用，基于飞蝗V-ATPase-V0结构域中包含的飞蝗V-ATPase-a、V-ATPase-c、V-ATPase-c”、V-ATPase-d、V-ATPase-e基因，对于其中每一个基因，通过primerpremier5.0软件设计针对该基因的含有T7启动子的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得两端为T7启动子的DNA模板。按照HiScribeTMT7HighYieldRNASynthesisKit(NEWENGLANDInc.)试剂盒说明体外转录合成相应的dsRNA。通过微量注射器分别将每一个合成的dsRNA注射进入3龄飞蝗体腔内。结果表明：注射dsRNA后飞蝗V-ATPase-a基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致81％的死亡。注射dsRNA后飞蝗V-ATPase-c基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致96.8％的死亡。注射dsRNA后飞蝗V-ATPase-c”基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致96.8％的死亡。注射dsRNA后飞蝗V-ATPase-d基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致74.6％的死亡。注射dsRNA后飞蝗V-ATPase-e基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致90.5％的死亡。其中，在飞蝗V-ATPase-V0结构域基因的dsRNA的合成中，基于不同的基因，设计的上游引物和下游引物如下所示：飞蝗V-ATPase-a基因的上游引物和下游引物分别为：SEQIDNO：4和SEQIDNO：5；飞蝗V-ATPase-c基因的上游引物和下游引物分别为：SEQIDNO：9和SEQIDNO：10；飞蝗V-ATPase-c”基因的上游引物和下游引物分别为：SEQIDNO：14和SEQIDNO：15；飞蝗V-ATPase-d基因的上游引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.飞蝗V-ATPase-V0结构域基因，其特征是：包括以下基因：/n飞蝗V-ATPase-a基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1；/n飞蝗V-ATPase-c基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：6；/n飞蝗V-ATPase-c”基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：11；/n飞蝗V-ATPase-d基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：16；/n飞蝗V-ATPase-e基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：21。/n

【技术特征摘要】
1.飞蝗V-ATPase-V0结构域基因，其特征是：包括以下基因：
飞蝗V-ATPase-a基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：1；
飞蝗V-ATPase-c基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：6；
飞蝗V-ATPase-c”基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：11；
飞蝗V-ATPase-d基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：16；
飞蝗V-ATPase-e基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：21。


2.飞蝗V-ATPase-V0结构域基因片段，其特征是：包括以下基因片段：
飞蝗V-ATPase-a基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：3；
飞蝗V-ATPase-c基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：8；
飞蝗V-ATPase-c”基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：13；
飞蝗V-ATPase-d基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：18；
飞蝗V-ATPase-e基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：23。


3.飞蝗V-ATPase-V0结构域基因的dsRNA，其特征是：包括以下dsRNA：
由飞蝗V-ATPase-a基因片段SEQIDNO：3合成的dsRNA；
由飞蝗V-ATPase-c基因片段SEQIDNO：8合成的dsRNA；
由飞蝗V-ATPase-c”基因片段SEQIDNO：13合成的dsRNA；
由飞蝗V-ATPase-d基因片段SEQIDNO：18合成的dsRNA；
由飞蝗V-ATPase-e基因片段SEQIDNO：23合成的dsRNA。


4.飞蝗V-ATPase-V0结构域基因的dsRNA的合成方法，其特征是：分别以含有飞蝗V-ATPase-a基因SEQIDNO：1、V-ATPase-c基因SEQIDNO：6、V-ATPase-c”基因SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建珍，刘晓健，梁晓宇，史学凯，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14