一种特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法技术

本发明专利技术首先以采摘24h的成熟油橄榄果为原料，25℃下物理压榨制备酸度小于0.8的特级初榨橄榄油；然后通过离心分离萃取(Centrifugal Partition Extraction，CPE)得到其总多酚提取物浸膏；再通过离心分配色谱技术(Centrifugal Partition Chromatography，CPC)并结合薄层层析色谱分析和制备液相色谱技术得到oleocanthal浓缩样品；最后，利用核磁共振、质谱技术进行结构鉴定和纯度分析，从而制备得到高纯度oleocanthal，本发明专利技术实验可快速、高效制备得到大量较高纯度的oleocanthal。

【技术实现步骤摘要】
一种特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法
本专利技术涉及日常用品
，涉及一种一种特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法。
技术介绍
橄榄油含有大量的单不饱和脂肪酸如油酸，以及亚油酸、亚麻酸等多不饱和脂肪酸，还含有各种维生素和抗氧化物等，其中不饱和脂肪酸含量高达82％～87％。特级初榨橄榄油是指酸度不超过0.8的橄榄油，是由新鲜的橄榄果在采摘24h内通过物理压榨的方法，得到其纯天然果汁后再经油水分离制备产生的质量最好的橄榄油，不含任何防腐剂和添加剂成份。在过去的十年中，许多流行病学研究已将特级初榨橄榄油的摄入与预期寿命延长和与年龄有关的疾病的发生率降低相关联。这是因为特级初榨橄榄油中富含的oleocanthal是一种功能强大的非甾体抗炎药，与布洛芬相似，对神经退行性疾病，关节退行性疾病和癌症具有治疗作用，研究表明其在阿尔茨海默氏病治疗中可发挥重要作用。阿尔茨海默氏病是影响老年人口的最常见神经退行性疾病，是老年期痴呆中最常见的病理类型。早期以明显记忆下降为主，逐渐丧失日常生活能力，并伴有精神症状和行为障碍，病情呈进行性进展，晚期常出现吞咽困难，卧床不起，发病十年左右，常因感染等并发症死亡。在欧美国家，65岁以上老年人中发病率为5％，85岁以上发病率达到30％以上，我国65岁及以上人群老年期痴呆患病率为5.56％。目前，其对症治疗药物，主要由乙酰胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐，卡巴拉汀和加兰他敏)和一种谷氨酸受体拮抗剂组成。但是，这些治疗只能有限的改善症状，都不具有治愈或改变疾病的作用。研究表明，添加富含oleocanthal特级初榨橄榄油作为医疗食品可扩大多奈哌齐的治疗效果，仅通过增加多奈哌齐的剂量就无法达到该效果，因为这种增加可能会触发不良的胆碱能副作用。其中，医疗食品被定义为特殊类别的产品，旨在通过医学评估并基于公认的科学原理，针对特定饮食管理某种疾病或具有独特营养要求的疾病。但是，由于特级初榨橄榄油在直接食用时具有明显的辛辣、苦涩的刺激性感官特性，因此，国内特级初榨橄榄油直接食用的不多，同时由于其价格较贵，不饱和脂肪酸和oleocanthal等都易氧化变质，使得目前国内相关的市场还存在较大空白。为了避免以上问题并保持oleocanthal本身活性，便于后期研究能够用于国内阿尔兹海默症的相关工作，本专利技术是一种从特级初榨橄榄油中富集纯化oleocanthal的新型制备方法，从新鲜橄榄果的采摘、压榨、总多酚富集到oleocanthal的富集、纯化。本专利技术应用了离心分配色谱技术(CentrifugalPartitionChromatography，CPC)，由Nunogaki专利技术，CPC属于现代逆流色谱技术的一种，其原理是液-液萃取，即采用特殊的旋转式不锈钢柱，其固定相和流动相均为液体，CPC柱的末端带有旋转密封器，使得溶剂进入转子，旋转柱本体由带有数千个相连分离腔的不锈钢碟片堆叠，这个特殊的设计保证了固定相溶剂在离心力下保留，而流动相溶剂则可以流过并完成萃取。目前，该方法由于分离速度快、效率高，在国外天然活性产物的分离、纯化中广泛应用，但国内目前还鲜有报道，因此，本申请将以此为基础进行oleocanthal的富集、纯化。另外，本专利技术也会用到离心分离萃取(CentrifugalPartitionExtraction，CPE)，作为一种高生产率的无支撑液-液分离技术，可从植物提取物中分离出几种天然代谢物，例如皂苷，芥子油苷，生物碱，酚酸和多酚。CPE和CPC之间的主要区别取决于分离柱的长度。对于同等的色谱柱容量，CPE转子包含较少的较大体积的分隔室，后者通过较大的管道串联连接。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种一种特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法。本专利技术的另一个目的是提供上述一种可以用于预防和改善阿兹海默症的医疗食品添加剂的制备方法。本专利技术是按照以下方案来实施的：本专利技术原料有：新鲜采摘的成熟橄榄果。步骤1、取新鲜采摘的成熟橄榄果，进行物理压榨，得到其纯天然果汁后再经油水分离得到特级初榨橄榄油；步骤2、将特级初榨橄榄油与正己烷混合，注入到CPE柱体内，流动相和固定相分别为甲醇、蒸馏水、正己烷、乙酸乙酯，设定流速50～100mL/min，转速200～1000rpm/min，重复5～10次，每次约30～60min；步骤3、将获得的水相在40℃的真空下蒸发至干，得到粘稠的提取物，萃取除去残留脂肪，浓缩得总多酚提取物浸膏，4℃下冷藏放置备用；步骤4、取总多酚提取物浸膏，甲醇溶解后，注入到CPC柱体内，流动相和固定相分别为甲醇、蒸馏水、正己烷、乙酸乙酯，设定流速20～100mL/min，转速300～900rpm/min，每10mL收集一次，得萃取样品溶液；步骤5、根据萃取样品溶液的薄层层析色谱分析，40℃的真空下，将相似Rf值得样品浓缩，得到含有oleocanthal的提取物浸膏，4℃下冷藏放置备用；步骤6、取oleocanthal提取物浸膏，甲醇溶解后，进行制备液相纯化，流动相为乙腈、水梯度洗脱，根据不同出峰时间进行样品收集，同时进行薄层层析色谱分析；步骤7、根据薄层层析色谱分析结果与oleocanthal标准品比对，找到oleocanthal峰对应样品，立即于40℃水浴温度下浓缩，然后置于真空干燥器中过夜；步骤8、取干燥后的oleocanthal浓缩样品，用氘代甲醇溶解后，利用核磁共振技术进行结构鉴定和初步的纯度分析，与已知标准品比对，若纯度达到95％以上则可行，否则重复步骤6～8，最终用质谱分析得到最终纯度。本专利技术的特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法还在于：本专利技术的特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法第一步中新鲜橄榄果的压榨24h之内，25℃以下物理压榨，且橄榄油酸度小于0.8。本专利技术的特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法第二、四步中CPE柱体内，流动相和固定相正己烷、乙酸乙酯、甲醇、蒸馏水的比例为4∶1∶2∶3，3∶2∶2∶3，2∶3∶2∶3，1∶4∶2∶3中的一种或几种。本专利技术的特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法第三步中萃取剂为甲醇、乙腈、正己烷、石油醚中的一种或几种。本专利技术的特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法第五步中薄层层析色谱展开剂为二氯甲烷与甲醇体积比90∶10～95∶5。本专利技术的特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法第六步中制备液相的流动相为乙腈∶水为7∶3～1∶9。本专利技术实验操作简便但需谨慎，可快速制备得到大量较纯的oleocanthal，方法十分高效。附图说明附图1是CPC装置图；具体实施方式以下实施例为本专利技术的一些举例，不应被看做是对本专利技术的限定。实施例步骤1、取新鲜采摘24h的成熟橄榄果，品种莱星，25℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法，其步骤如下：/n第一步，取新鲜采摘的成熟橄榄果，进行物理压榨，得到其纯天然果汁后再经油水分离得到特级初榨橄榄油；/n第二步，将特级初榨橄榄油与正己烷混合，注入到CPE柱体内，流动相和固定相分别为甲醇、蒸馏水、正己烷、乙酸乙酯，设定流速50～100mL/min，转速200～1000rpm/min，重复5～10次，每次约30～60min；/n第三步，将获得的水相在40℃的真空下蒸发至干，得到粘稠的提取物，萃取除去残留脂肪，浓缩得总多酚提取物浸膏，4℃下冷藏放置备用；/n第四步，取总多酚提取物浸膏，甲醇溶解后，注入到CPC柱体内，流动相和固定相分别为甲醇、蒸馏水、正己烷、乙酸乙酯，设定流速20～100mL/min，转速300～900rpm/min，每10mL收集一次，得萃取样品溶液；/n第五步，根据萃取样品溶液的薄层层析色谱分析，40℃的真空下，将相似Rf值得样品浓缩，得到含有oleocanthal的提取物浸膏，4℃下冷藏放置备用；/n第六步，取oleocanthal提取物浸膏，甲醇溶解后，进行制备液相纯化，流动相为乙腈、水梯度洗脱，根据不同出峰时间进行样品收集，同时进行薄层层析色谱分析；/n第七步，根据薄层层析色谱分析结果与oleocanthal标准品比对，找到oleocanthal峰对应样品，立即于40℃水浴温度下浓缩，然后置于真空干燥器中过夜；/n第八步，取干燥后的oleocanthal浓缩样品，用氘代甲醇溶解后，利用核磁共振技术进行结构鉴定和初步的纯度分析，并与已知标准品比对，若纯度达到95％以上则可行，否则重复步骤6～8，最终用质谱分析得到最终纯度。/n...

【技术特征摘要】
1.一种特级初榨橄榄油中oleocanthal的富集纯化制备方法，其步骤如下：
第一步，取新鲜采摘的成熟橄榄果，进行物理压榨，得到其纯天然果汁后再经油水分离得到特级初榨橄榄油；
第二步，将特级初榨橄榄油与正己烷混合，注入到CPE柱体内，流动相和固定相分别为甲醇、蒸馏水、正己烷、乙酸乙酯，设定流速50～100mL/min，转速200～1000rpm/min，重复5～10次，每次约30～60min；
第三步，将获得的水相在40℃的真空下蒸发至干，得到粘稠的提取物，萃取除去残留脂肪，浓缩得总多酚提取物浸膏，4℃下冷藏放置备用；
第四步，取总多酚提取物浸膏，甲醇溶解后，注入到CPC柱体内，流动相和固定相分别为甲醇、蒸馏水、正己烷、乙酸乙酯，设定流速20～100mL/min，转速300～900rpm/min，每10mL收集一次，得萃取样品溶液；
第五步，根据萃取样品溶液的薄层层析色谱分析，40℃的真空下，将相似Rf值得样品浓缩，得到含有oleocanthal的提取物浸膏，4℃下冷藏放置备用；
第六步，取oleocanthal提取物浸膏，甲醇溶解后，进行制备液相纯化，流动相为乙腈、水梯度洗脱，根据不同出峰时间进行样品收集，同时进行薄层层析色谱分析；
第七步，根据薄层层析色谱分析结果与oleocanthal标准品比对，找到oleocanthal峰对应样品，立...

【专利技术属性】
技术研发人员：王成章，李文君，叶建中，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林产化学工业研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32