本发明专利技术涉及功能化多能干细胞纳米囊泡制剂的制备及其在防治肺炎中的用途，属于生物医药技术领域。所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂是将多能干细胞的培养上清去除死细胞、细胞碎片，富集浓缩后获得的。本发明专利技术还提供了载有药物的功能化纳米囊泡制剂。并进一步提供了所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂或载有药物的功能化纳米囊泡制剂在制备治疗肺炎或肺损伤药物上的应用。与现有技术相比，本发明专利技术利用EVs负载法匹拉韦等抗病毒药物，构建既具有抗炎调节免疫又具有直接抑制RNA病毒复制的EVs，很有可能为新型冠状病毒等烈性RNA病毒引起的难治性病毒性肺炎提供有效治疗手段。
【技术实现步骤摘要】
功能化多能干细胞纳米囊泡制剂的制备及其在防治肺炎中的用途
本专利技术属于生物医药
，尤其是涉及功能化多能干细胞纳米囊泡制剂的制备及其在防治肺炎中的用途。
技术介绍
研究表明，人类冠状病毒感染后，炎性单核细胞-巨噬细胞和中性粒细胞在肺部积聚，这些细胞是细胞因子和趋化因子的主要来源[L.E.Gralinski,R.S.Baric,Molecularpathologyofemergingcoronavirusinfections,JPathol235(2)(2015)185-95；R.Channappanavar,S.Perlman,Pathogenichumancoronavirusinfections:causesandconsequencesofcytokinestormandimmunopathology,SeminImmunopathol39(5)(2017)529-539.]。病毒的快速复制和旺盛的促炎细胞因子/趋化因子反应导致肺上皮细胞和内皮细胞凋亡，破坏了肺微血管和肺泡上皮细胞屏障，导致血管渗漏和肺泡水肿，影响血气交换并最终导致机体缺氧[L.E.Gralinski,R.S.Baric,Molecularpathologyofemergingcoronavirusinfections,JPathol235(2)(2015)185-95.]。相关临床资料表明，新型冠状病毒(2019-nCoV)导致的危、重症新冠肺炎病人约占20％[L.The,Emergingunderstandingsof2019-nCoV,Lancet395(10221)(2020)311.]；新冠病毒肺炎的主要病理机制是过激的免疫反应导致的大量自由基引起肺等重要器官损伤[Y.C.Wu,C.S.Chen,Y.J.Chan,OverviewofThe2019NovelCoronavirus(2019-nCoV):ThePathogenofSevereSpecificContagiousPneumonia(SSCP),JChinMedAssoc(2020).]。此外，一些患者病情的突然逆转加重与炎症风暴的发生密切相关[L.The,Emergingunderstandingsof2019-nCoV,Lancet395(10221)(2020)311.]。多能干细胞包括胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)，属最原始最幼稚的全能干细胞。多能干细胞如ESC具备类似妊娠期胚胎拥有的免疫特权，可规避同种异体的免疫学反应，在调节免疫反应方面有其独特优势。这是由于ESC具有非常低水平的MHCI表达和MHCII,CD80,CD86及CD40L的表达缺失。研究已发现ESC具有强大的免疫调节特性，人、小鼠和大鼠的胚胎干细胞均具有抑制T淋巴细胞增殖，即使是在有部分抗原提呈细胞存在的情况下[Li,L.,Baroja,M.L.,Majumdar,A.,etal.(2004).Humanembryonicstemcellspossessimmune-privilegedproperties.StemCells,22,448–456.；Koch,C.A.,Geraldes,P.,&Platt,J.L.(2008).Immunosuppressionbyembryonicstemcells.StemCells,26,89–98.]。但多能干细胞直接体内移植存在形成畸胎瘤的风险，因此无法直接用于临床疾病的治疗。研究发现干细胞主要是通过旁分泌机制发挥其生物学功能[C.B,L.Q,Z.B,W.Y,StemCell-DerivedExtracellularVesiclesasaNovelPotentialTherapeuticToolforTissueRepair,Stemcellstranslationalmedicine6(9)(2017)1753-1758.]。那么多能干细胞分泌的细胞外囊泡(PSC-EVs)是否具有多能干细胞自身类似的免疫调节功能目前尚未见报道。同样，亦未见PSC-EVs在抑制炎症反应方面的报道。
技术实现思路
针对新型冠状病毒等烈性RNA病毒引起的难治性病毒性肺炎的问题，本专利技术提供功能化多能干细胞纳米囊泡制剂的制备及其在防治肺炎中的用途。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：第一方面，本专利技术提供一种多能干细胞来源的纳米囊泡制剂。进一步地，所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂为诱导多能干细胞或胚胎干细胞来源的纳米囊泡制剂。第二方面，本专利技术提供多能干细胞来源的纳米囊泡制剂的制备方法。多能干细胞来源的纳米囊泡制剂(PSC-EVs)的制备方法可以采用以下方式获得：1、将多能干细胞的培养上清去除死细胞、细胞碎片等物质，富集浓缩，得到多能干细胞来源的纳米囊泡制剂。2、物理挤压方法：消化收集一定数量的iPSC单个细胞，PBS重悬细胞，混匀细胞，利用脂质体挤压器，由大到小依次通过不同直径的微米级与纳米级过滤膜，得到囊泡混合溶液，进一步通过超滤或超速离心获得纳米囊泡制剂(PSC-EVs)。采用物理挤压方法的一个实施方式中，PBS重悬细胞的浓度为1-9×108个细胞。采用物理挤压方法的一个实施方式中，由大到小依次通过不同直径的微米级与纳米级过滤膜为依次通过5μm、2μm、800nm、500nm、200nm、100nm、50nm的过滤膜。细胞在自然状态下分泌的EVs数量有限、周期长，难于直接进行工程化生产。采用物理挤压方法获得的纳米囊泡制剂(PSC-EVs)，与天然分泌EVs具有相似的结构、粒径和膜蛋白，但是囊泡的产量可提高数百倍，有效降低了囊泡制备的成本，具有重要的实际应用潜力。进一步，本专利技术进一步提供了临床级诱导多能干细胞系(iPSC)来源的纳米囊泡制剂(PSC-EVs)的制备方法，具体如下：临床级诱导多能干细胞系(iPSC)的构建与生产全程使用无血清、化学成分明晰的培养体系。细胞的构建可以采用本领域技术人员的常规技术手段。操作时，严格按照质控标准进行质量控制。大量扩增收集的临床级iPSC培养上清，通过离心、过滤等多种方式或者组合方式分别去除死细胞、细胞碎片等物质，富集浓缩成纳米囊泡制剂(PSC-EVs)，将PSC-EVs进行分装冻存。诱导多能干细胞系(iPSC)来源的纳米囊泡制剂(PSC-EVs)的表征：通过透射电镜观察了所制备的纳米囊泡的形貌，可见纳米囊泡呈“杯状”结构；通过免疫印迹技术对纳米囊泡的标记物进行了鉴定，结果显示其表达CD63、CD9、Tsg101，不表达GM130；通过纳米流式技术检测，所制备的囊泡粒径主要分布在50-150nm。证明PSC-EVs属于直径在50-150nm的小囊泡。第三方面，本专利技术提供一种载有药物的功能化纳米囊泡制剂。所述功能化纳米囊泡制剂包括纳米囊泡制剂，所述纳米囊泡制剂载有药物，所述药物包括法匹拉韦、奈非那韦、洛匹那韦、利托那韦或恩曲他滨丙酚替诺福韦中的一种或几种。新冠病毒是本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多能干细胞来源的纳米囊泡制剂，其特征在于，所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂是将多能干细胞的培养上清去除死细胞、细胞碎片，富集浓缩后获得的，所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂的纳米囊泡呈“杯状”结构；所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂表达CD63、CD9、Tsg101，不表达GM130；所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂的囊泡粒径主要分布在50-150nm。/n
【技术特征摘要】
1.一种多能干细胞来源的纳米囊泡制剂，其特征在于，所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂是将多能干细胞的培养上清去除死细胞、细胞碎片，富集浓缩后获得的，所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂的纳米囊泡呈“杯状”结构；所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂表达CD63、CD9、Tsg101，不表达GM130；所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂的囊泡粒径主要分布在50-150nm。
2.根据权利要求1所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂，其特征在于，所述多能干细胞来源的纳米囊泡制剂为诱导多能干细胞或胚胎干细胞来源的纳米囊泡制剂。
3.一种载有药物的功能化纳米囊泡制剂，其特征在于，所述功能化纳米囊泡制剂包括如权利要求1或2所述的多能干细胞来源的纳米囊泡制剂，所述纳米囊泡制剂载有药物。
4.根据权利要求3所述一种载有药物的功能化纳米囊泡制剂，其特征在于，所述药物包括可抑制病毒RNA聚合酶或可抑制蛋白激酶或可抑制逆转录酶的药物；
优选地，选自法匹拉韦、奈非那韦、洛匹那韦、利托那韦或恩曲他滨丙酚替诺福韦中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述一种载有药物的功能化纳米囊泡制剂，其特征在于，所述功能...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪洪，何建氢，
申请(专利权)人：上海希晗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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