一种乙型肝炎病毒HBV来源HBx蛋白的制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体为一种乙型肝炎病毒HBV来源HBx蛋白包涵体的可溶化和纯化方法。该制备方法包括以下步骤：使用重组表达系统表达HBx；收集含有重组表达的HBx蛋白的细胞，在冷却条件下使用裂解缓冲液破细胞，收集含有HBx蛋白包涵体的部分；在上述获得的含有HBx蛋白包涵体的部分中，加入溶解缓冲液重悬，变性；对上述产物复性并去除核酸，纯化，获得HBx蛋白；上述步骤在小于等于10℃的环境条件下完成。使用本发明专利技术的方法可得到稳定均一的单体HBx样品，浓度可达到15mg/ml。该蛋白样品可以作为科学研究试剂，利用该蛋白样品还可以制备HBx的单克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】
一种乙型肝炎病毒HBV来源HBx蛋白的制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种乙型肝炎病毒HBV来源HBx蛋白包涵体的可溶化和纯化方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV病毒)中的HBx蛋白，是病毒感染后在人体内复制、引起肝炎和肝癌的关键蛋白，是HBV感染引起相关疾病的一个重要靶标蛋白。HBx蛋白大小约为16.6kDa，由154个氨基酸残基组成，目前还缺乏对于该蛋白结构与功能的基本了解。该蛋白能自发聚合，并具有很强的核酸结合能力，这使得在各种表达系统中都无法顺利获得均一可溶的HBx蛋白样品。使用已报导的结合Trx、MBP等融合蛋白重组表达或变复性方法还无法获得高纯度的、稳定均一的蛋白样品。以前获得的HBx蛋白的缺点在于：一是仍为低可溶性状态，文献报导中最高浓度仅能达到1mg/ml左右；二是仍然未能去除结合的核酸，表现在样品OD260/280(在260nm和280nm的吸光光度比值)接近或大于1，远远高于纯蛋白的正常比值(约0.57)。基于目前这些蛋白样品研究获得的数据，研究结果常常难以被其他实验室重复。获得稳定均一的、可溶有活性的该靶标蛋白一直是个未能攻克的难关，严重限制了HBV感染引起疾病过程中HBx的具体功能机制研究和以该蛋白为靶点的相关药物研发。申请人先前将HBx蛋白的核心区段(包含第12到第127个氨基酸)从包涵体进行正确的复性折叠，并纯化后得到浓度达到20mg/ml左右、稳定均一的、高纯度的单体样品，并以“一种HBV中HBx蛋白核心区段的可溶化和纯化及单克隆抗体”的名称提交了中国专利技术专利申请，申请号或专利号为201810308380.3。而包含所有氨基酸的全长HBx蛋白，目前还未有公开报导的方法可以获得稳定均一的、高度折叠的、可溶的蛋白样品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种稳定均一的、高度折叠的、可溶的HBx全长蛋白样品的制备方法。本专利技术将大肠杆菌中重组表达的乙型肝炎病毒来源的HBx包涵体蛋白，通过变复性去除结合的核酸并纯化获得稳定均一的、高度折叠的、可溶的HBx单体样品，可以大幅提高样品产量和纯度。获得的HBx蛋白单体样品可以作为科研试剂，利用该蛋白样品还可以制备HBx的单克隆抗体。本专利技术在此基础上完成。本专利技术提供了一种HBx蛋白的制备方法，包括以下步骤：使用重组表达系统表达HBx；收集含有重组表达的HBx蛋白的细胞，在冷却条件下使用裂解缓冲液破细胞，收集含有HBx蛋白包涵体的部分；在获得的含有HBx蛋白包涵体的部分中，加入溶解缓冲液重悬搅拌均匀直到无明显沉淀，之后离心取上清；使用亲和层析柱纯化,得到可溶的、变性的HBx；复性，去除核酸；将复性后的样品通过分子筛进行纯化，去除核酸，获得稳定均一的、高度折叠的、可溶的HBx蛋白；上述步骤在小于等于10℃的环境条件下完成。本专利技术使用的HBx氨基酸序列(UniProtKB/TrEMBL序列号Q8V1I7)如SEQ.ID.NO1所示：MAARVCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLSSPSSSTVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLAAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFTSA。其中,所述的重组表达系统是大肠杆菌表达系统。例如，采用源自大肠杆菌的表达系统。较好的，重组表达的HBx存在于包涵体中，选择的标签是His标签。在本专利技术的一个优选例中，对收集的包涵体进一步洗涤，使用洗涤缓冲液(例如：50mMTris-HClpH8.0,3.5M尿素,300mM氯化钠)重悬、洗涤HBx包涵体2-3次。本专利技术中使用的裂解缓冲液是Tris-HCl缓冲液。例如，在本专利技术的一个优选例中，使用的裂解缓冲液含有50mMTris-HClpH8.0,3.0M尿素,300mM氯化钠。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的溶解缓冲液的成分是8M尿素,50mM咪唑，50mM氯化钠，10mMβ-巯基乙醇。本专利技术中，亲和层析可以采用Ni亲和层析，亲和层析中使用溶解缓冲液和上样缓冲液，这两者均含有尿素、咪唑、氯化钠和β-巯基乙醇。在本专利技术的一个优选实施例中，上样缓冲液成分为：8M尿素,50mM咪唑，50mM氯化钠，5mMβ-巯基乙醇；洗脱缓冲液成分为8M尿素,1M咪唑，50mM氯化钠，5mMβ-巯基乙醇。本专利技术中可以采用透析方式进行复性。较好的，分子筛纯化的介质是Superdex75或Superdex200。本专利技术中，分子筛纯化或者透析所使用的缓冲液的pH值范围是4.0-5.0。例如，透析液为100mM醋酸钠pH4.0-5.0,50mM氯化钠,5％甘油，分子筛缓冲液为：100mM醋酸钠pH4.0-5.0,50mM氯化钠。较好的，该制备方法还可以加入去垢剂促进包涵体蛋白溶解，加入核酸酶帮助去除核酸。本专利技术提供的HBx全长蛋白的可溶化和纯化方法，是将含HBx序列的质粒转化到大肠杆菌Rosetta菌株进行重组表达得到HBx包涵体，然后对包涵体蛋白进行变性、复性和纯化，得到稳定均一、高度折叠、可溶的HBx蛋白样品，获得的样品以单体形式存在。在本专利技术的一个优选实施例中，HBx包涵体可溶化和纯化方法的具体步骤如下：(1)收集：收集1L重组表达HBx包涵体的大肠杆菌，用30mL裂解缓冲液(例如：50mMTris-HClpH8.0,3.0M尿素,300mM氯化钠)在循环液冷却破菌机(4℃，1000～1500MPa)中破菌3-4次，之后在4℃条件下18000g离心40min收集含有HBx包涵体的不溶物；(2)洗涤：使用洗涤缓冲液(例如：50mMTris-HClpH8.0,3.5M尿素,300mM氯化钠)重悬、洗涤HBx包涵体2-3次；(3)变性重悬：将包涵体沉淀用玻璃棒碾匀后使用10mL溶解缓冲液(例如：8M尿素,50mM咪唑，50mM氯化钠，10mMβ-巯基乙醇)在室温下重悬搅拌均匀，约需1h直到无明显沉淀，之后离心取上清；(4)亲和纯化：使用亲和层析Ni柱纯化变性的HBx。其中，使用上样缓冲液(例如：8M尿素,50mM咪唑，50mM氯化钠，5mMβ-巯基乙醇)和洗脱缓冲液(例如：8M尿素,1M咪唑，50mM氯化钠，5mMβ-巯基乙醇)，得到可溶的、变性的HBx；(5)复性：使用透析复性的方式将变性的HBx进行复性。具体是将前述得到的可溶的、变性的HBx样品置于1L的透析液(例如：100mM醋酸钠pH4.0-5.0,50mM氯化钠,5％甘油)中透析4h，并换新鲜的透析液重复透析2-3次，透析过程置于10℃冷柜中；(6)分子筛纯化：使用分子筛缓冲液(例如：100mM醋酸钠pH4.0-5.0,50mM氯化钠)，将复性后的样品通过Superdex75或Superdex200分子筛进行纯化，之后使用分子筛缓冲液可将HBx浓缩完成制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HBx蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/n(a)使用重组表达系统表达HBx；/n(b)收集含有重组表达的HBx蛋白的细胞，在冷却条件下使用裂解缓冲液破细胞，收集含有HBx蛋白包涵体的部分；/n(c)在步骤(b)获得的含有HBx蛋白包涵体的部分中，加入溶解缓冲液重悬搅拌均匀直到无明显沉淀，之后离心取上清；/n(d)使用亲和层析柱纯化HBx,得到可溶的、变性的HBx；/n(e)HBx蛋白复性，去除核酸；/n(f)将复性后的样品通过分子筛进行纯化，去除核酸，获得HBx蛋白；/n上述步骤在小于等于10℃的环境条件下完成。/n

【技术特征摘要】
1.一种HBx蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(a)使用重组表达系统表达HBx；
(b)收集含有重组表达的HBx蛋白的细胞，在冷却条件下使用裂解缓冲液破细胞，收集含有HBx蛋白包涵体的部分；
(c)在步骤(b)获得的含有HBx蛋白包涵体的部分中，加入溶解缓冲液重悬搅拌均匀直到无明显沉淀，之后离心取上清；
(d)使用亲和层析柱纯化HBx,得到可溶的、变性的HBx；
(e)HBx蛋白复性，去除核酸；
(f)将复性后的样品通过分子筛进行纯化，去除核酸，获得HBx蛋白；
上述步骤在小于等于10℃的环境条件下完成。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述的重组表达系统是大肠杆菌表达系统。


3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中以包涵体蛋白的方式进行表达时，选择的标签是His标签。


4.如权利要求1所述的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡小健，李继喜，王森，苏晓琴，李龙，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31