一种石斛的全二维液相分离方法技术

本发明专利技术涉及天然药物中活性成分分离技术领域，为解决传统石斛属植物提取方法程序繁琐、使用有毒溶剂、提取效率和回收率低的问题，提供了一种石斛的全二维液相分离方法，包括以下步骤：(1)将石斛原料粉碎，过三号筛，得石斛粉末；(2)将石斛粉末采用基质固相分散提取法进行提取，得石斛提取液；(3)将石斛提取液通过二维超高效液相色谱与质谱联用进样分析表征分离效果。本发明专利技术将二维超高效液相色谱与质谱联用技术与基质固相萃取技术巧妙结合起来，实现便捷高效地分离提取天然产物中的有效成分。

【技术实现步骤摘要】
一种石斛的全二维液相分离方法
本专利技术涉及天然药物中活性成分分离
，尤其涉及一种石斛的全二维液相分离方法。
技术介绍
二维超高效液相色谱是一种理想而强大的工具，由于其峰容量大，分辨率高，因此在解决复杂性方面引起了更多的关注。在二维超高效液相色谱系统中，峰、部分或整个色谱图在各种色谱柱的帮助下经历不同的分离机制。二维超高效液相色谱方法可分为全二维和多中心切割，其依赖于样品的所有组分是否都转移到第二维。在全二维模式中，第一维的全部组分被送至第二维。这通过将一维检测器的效率收集到两个循环中来获得，所述循环交替地移位到二维色谱柱中。该组合要求第二维快速分离(分离时间代表性的小于1分钟)以提高采样频率并保持一维分离。此外，上述方案可用于分离复杂化合物，同时与质谱联用，已用于分离蛋白质、草药提取物和天然产物中的活性成分。石斛属植物是一种重要的滋补品和功能性食品，属于兰科植物中的多年生草本植物.。石斛有成千上百种，包括铁皮石斛、霍山石斛、金钗石斛、黄草石斛、铜皮石斛和鼓槌石斛等，其中主要分布于中国的浙江、安徽、贵州和云南。石斛属中含有多种活性成分，例如多糖、黄酮、生物碱、芪类、氨基酸、菲类、联苄和酚类等。而且石斛属物种具有重要的药理作用，并提供大量的有益功能，如消热，增强视力，维持胃张力，改善体液产生和免疫调节影响等。由于石斛属重要的药理作用，因此开发和研究石斛的质量控制方法是必要的。然而，根据现有的文献报道，其样品前处理方法很复杂，缺乏更全面的方法来分析石斛属中的活性成分。现有的文献有多种石斛属植物提取方法，比如说超声/微波辅助固液分散提取，加压液体提取，索氏提取，代谢提取，机械化学提取，DNA提取等。然而，这些大多数提取方法操作繁琐，耗费时间、金钱和劳动力。而且，这些方法通常涉及繁琐的程序，使用有毒的有机溶剂，方法条件处于高温或暴露于辐射，消耗大量的样品和溶剂，导致提取方法提取效率和回收率低。因此，利用高效绿色的样品预处理方法和高精密度的色谱技术来分析、测定和分离铁皮石斛中的痕量化合物是必不可少的。
技术实现思路
本专利技术为了克服传统石斛属植物提取方法程序繁琐、使用有毒溶剂、提取效率和回收率低的问题，提供了一种分离度高、灵敏度高的石斛的全二维液相分离方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种石斛的全二维液相分离方法，包括以下步骤：(1)将石斛原料粉碎，过三号筛，得石斛粉末；(2)将石斛粉末采用基质固相分散提取法进行提取，得石斛提取液；(3)将石斛提取液通过二维超高效液相色谱与质谱联用进样分析表征分离效果。本专利技术方法分离环节创意新颖，思路巧妙。成功采用二维液相与质谱联用作为分析方法用于天然产物提取和分离的领域，并在全二维模式下实现石斛中16种化合物的成功分离和鉴定。该分离检测体系具备一系列优异突出的特性：操作简单、仪器灵敏度和稳定性良好，操作环境安全可靠。本专利技术提供的实验提取和分离效果高效显著，且操作环境安全，操作步骤简洁明了。作为优选，所述基质固相分散提取法包括以下步骤：将石斛粉末与分散剂混合研磨后，将所得混合物填充入固相萃取小柱，经洗脱、离心，取上层清液得石斛提取液。与传统方法相比，基质固相分散方法解决了样品和有机溶剂消耗大的问题，缩短了提取时间。基质固相分散微提取方法提取的石斛属植物成分明显高于传统提取方法，其含量也明显增加；经过基质固相分散提取方法处理之后，仪器的灵敏度大大提高，重现性也得以提高，使得在测定石斛属类植物药材中的16种成分更加精确有效。并且本专利技术技术的简单适用性以及它便捷可重复性使其成为中药提取研究中的有用工具。作为优选，所述分散剂为C18分散剂；所述C18分散剂与石斛粉末的质量比为(1～2)：1。本专利技术采用的C18分散剂，不仅廉价易得，而且具备一系列优异突出的性质：化学稳定性和热稳定性良好，对人体无毒、不污染环境，不易燃。而且基质固相分散方法消耗较少的有机试剂、样品量和提取时间，较为环保绿色。作为优选，洗脱工艺中所用洗脱剂为纯甲醇。作为优选，所述一维液相的色谱柱的流速控制在0.05～0.11mL/min，优选为0.07mL/min。随着一维流速的增加，香草酸和丁香酸的分离率略有提高。接着随着流速继续增加，分离率急剧下降。最优的一维流速位于0.07mL/min，这是通过改变流速的方式改进了香草酸和丁香酸的分离来证明的。此外，其他两个重要对的分辨率与香草酸和丁香酸的分辨率有相同的变化趋势。另外两个关键对分别是牡荆素和牡荆素葡萄糖苷,芦丁和柚皮苷。总的来说，0.07mL/min被认为是最佳的一维流速，因为流速对三对化合物的分离率最高。作为优选，所述二维液相的色谱柱的流速控制在1.5～3.0mL/min，优选为2.0mL/min。为了使循环持续时间尽可能短，应该优先考虑相对较高的二维流速。设定合适的高流速，可以减小标准溶液和样品溶剂的影响，保证一维洗脱液体积不超过二维定量环。考虑到Poroshell120Bonus柱的规格和二维液相系统的耐压性能，流速对香草酸/丁香酸与芦丁/柚皮苷的分离有直接影响，因为流速越高，分离率越高。然而，牡荆素/牡荆素葡萄糖苷的分离率随着二维流速的增加而略有增加。相对而言，流速为2.0mL/min，允许足够的时间间隔，且二维分离可以很好地分辨出三对主要有效成分化合物。作为优选，所述一维液相的色谱条件为：色谱柱：SBC18(2.1×100mm,1.8μm)，柱温：50℃，进样量：2.0μL，检测波长：270nm，采样频率：40Hz，流速：0.07mL/min,流动相：A：0.05％甲酸水，B：甲醇。梯度洗脱：0min,20％B；3min,40％B；22min,50％B；25min,90％B；29min,100％B；35min,100％B；40min,100％B。SBC18柱可有效分离标准溶液，EclipsePlusC18、SBC18和AmideC16柱的分析时间比ChemicaC18WpH和Poroshell120EC-C18柱的短。一般来说，分离系统的正交性越好，分辨率越高。此外，所得的色谱柱间也有显著性差异。化学产物C18WpH、AmideC16、Poroshell120EC-C18响应差、正交性差、分离性差，因此，本专利技术优选SBC18(2.1×100mm,1.8μm)作为第一维的固定相。作为优选，所述二维液相的色谱条件为：色谱柱：Poroshell120Bonus(3.0×50mm，1.8μm)，柱温：50℃，进样量：2.0μL，检测波长270nm，采样频率，80Hz，流动相：A：0.05％甲酸水，B：乙腈；在全二维模式下，梯度停止时间为0.2min，梯度周期为0.35min，二维流速为2.0mL/min。EclipsePlusC18柱显示出较严重的目标分析物点扩散，ExtendC18柱显示出某些化合物无法检测或响应较差。然而，在保持流动相、流速和梯度不变的情况下，Poroshell120Bonus柱的性能与P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种石斛的全二维液相分离方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将石斛原料粉碎，过三号筛，得石斛粉末；/n(2)将石斛粉末采用基质固相分散提取法进行提取，得石斛提取液；/n(3)将石斛提取液通过二维超高效液相色谱与质谱联用进样分析表征分离效果。/n

【技术特征摘要】
1.一种石斛的全二维液相分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将石斛原料粉碎，过三号筛，得石斛粉末；
(2)将石斛粉末采用基质固相分散提取法进行提取，得石斛提取液；
(3)将石斛提取液通过二维超高效液相色谱与质谱联用进样分析表征分离效果。


2.根据权利要求1所述的一种石斛的全二维液相分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述基质固相分散提取法包括以下步骤：将石斛粉末与分散剂混合研磨后，将所得混合物填充入固相萃取小柱，经洗脱、离心，取上层清液得石斛提取液。


3.根据权利要求2所述的一种石斛的全二维液相分离方法，其特征在于，所述分散剂为C18分散剂；所述C18分散剂与石斛粉末的质量比为(1～2)：1。


4.根据权利要求2所述的一种石斛的全二维液相分离方法，其特征在于，洗脱工艺中所用洗脱剂为纯甲醇。


5.根据权利要求1所述的一种石斛的全二维液相分离方法，其特征在于，步骤(3)中，所述二维超高效液相色谱包括一维液相和二维液相；所述一维液相的色谱柱的流速控制在0.05～0.11mL/min；所述二维液相的色谱柱的流速控制在1.5～3.0mL/min。


6.根据权利要求5所述的一种石斛的全二维液相分离方法，其特征在于，步骤(3)中，所述一维液相的色谱条件为：
色谱柱：SBC18(2.1×100mm,1.8μm)，柱温：50℃，进样量：2.0μL，检测波长：270nm，采样频率：40Hz，流速：0.07mL/min,流动相：A：0.05％甲酸水，B：...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹君，王秋燕，胡雨涵，杨娟，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33