河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1、核苷酸序列、其多克隆抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了河豚毒素结合蛋白

【技术实现步骤摘要】
河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1、核苷酸序列、其多克隆抗体及其制备方法
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种河豚毒素结合蛋白，以及编码的核苷酸序列、其多克隆抗体。本专利技术还涉及了此河豚毒素结合蛋白的制备方法。
技术介绍
河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是一种小分子生物碱神经毒素，其分子式为C11H17O8N3，分子量为319。为氨基全氢喹唑啉型化合物，是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一。河豚毒素是典型的Na+通道阻滞剂,可以与肌肉神经细胞膜表面的Na+通道受体特异性结合，抑制神经细胞中Na+的流入，并阻止神经和肌肉之间的兴奋性传递。由河豚毒素引起的中毒事件在中国、日本和东南亚的一些国家经常发生，主要原因是误食有毒的河鲀。国内外学者对河豚毒素的来源进行了一系列的研究后发现，河豚毒素不仅存在于河鲀体内，而且广泛分布在其他动物体内，如纽虫、蝾螈、树蛙等一些两栖动物的体表。同时，发现多种细菌也可产生TTX。不同生物对TTX的耐受性差异很大，河鲀的毒性表现出明显的个体和区域差异。与无毒生物相比，富集大量TTX的有毒河鲀对TTX的耐受性更高。在海水河鲀中，肝脏和卵巢通常具有最高的毒性，其次是肠道和皮肤，肌肉和/或睾丸呈无毒或微弱。在有毒河鲀中，肝脏通常全年都表现出很高的毒性。卵巢在产卵期通过积累从肝脏转移的TTX而变得剧毒TTX在河鲀体内的转移，积累机制尚不清楚。研究发现，河豚毒素在生物体内能够与特定的蛋白结合，从而降低其毒性效应。河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1是河鲀体内发现的一类载体蛋白，可以与TTX结合，参与河豚毒素在体内的转运。对于河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1的获得多数学者采用直接从鱼体分离纯化的办法，但是所得产量较低，步骤繁琐，不容易大量获得。通过体外重组表达获得该蛋白的相关研究仅见于红鳍东方鲀和豹纹东方鲀，然而所获得的重组表达产物PSTBP1均无TTX结合活性。目前尚未见从菊黄东方鲀中分离纯化河豚毒素结合蛋白的相关报道。通过重组表达技术从不同种类的河鲀体内获得可使机体免于TTX毒性作用的结合蛋白，对于阐明TTX在河豚体内的转移、富集机制，进一步开发TTX解毒剂或检测试剂具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种河豚毒素结合蛋白(tfPSTBP1)、核苷酸序列、其制备方法及其多克隆抗体，以进一步应用于TTX的解毒剂，和(或)开发TTX的检测试剂等。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术公开了河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1，其含有如SEQIDNO:1所示的氨酸序列的多肽、或其多肽的活性片段。本专利技术还公开了编码河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还公开了一种多克隆抗体，采用河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1为抗原，免疫小鼠制备抗血清即得。本专利技术公开了上述河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.构建菊黄东方鲀河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1的重组表达载体；S2.将重组表达载体导入宿主细胞，对宿主细胞进行诱导表达及条件优化，获得表达产物；S3.表达产物经过滤，并通过亲和层析柱洗脱，收集洗脱峰即得重组蛋白。进一步地，步骤S1中以菊黄东方鲀肝脏制备的总RNA逆转录的cDNA为模版，克隆获得河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1的核苷酸序列。进一步地，构建前端引物tfPSTBP1F以及后端引物tfPSTBP1R以用于目的基因序列扩增，所述的引物tfPSTBP1F的序列为：GCAGATCTTTGTCTCAGAG，SEQIDNO:3；所述的引物tfPSTBP1R的序列为：GCTGACTGTGTTTACATTG，SEQIDNO:4。优选地，步骤S2中的宿主细胞为大肠杆菌，初始菌种浓度为OD600＝0.2，诱导温度为28℃，诱导时间为2.8h～3h，诱导剂为IPTG，载体为pET-32a。优选地，所述的步骤S3中亲和层析柱选用镍离子金属螯合亲和层析柱。进一步地，还包括如下步骤：S4.将洗脱下的蛋白放入透析袋中，4℃下在PBS溶液中透析5h～7h，更换透析液若干次，将样品从透析袋中取出，分装存放于-80℃保存。通过透析步骤可洗脱蛋白上的盐。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术首次克隆得到结合菊黄东方鲀河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1、其核苷酸序列，并制备了多克隆抗体。本专利技术利用pET-32a载体首次在大肠杆菌中成功表达菊黄东方鲀河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1，制备方法获得的重组蛋白具有纯度高，所需时间短，产量高等优点。本专利技术所用的溶液，配置简单，价格低廉。本专利技术所制备的河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1具有很高的TTX结合活性(平衡解离常数(kD)为0.32μM)，不仅可用于科研，还具有研制TTX解毒剂的潜力。此外，由于河豚毒素结合蛋白可特异地结合TTX，在开发作为TTX检测试剂的具有应用前景。附图说明图1为PET32a/tfPSTBP1重组菌株在不同条件下的诱导表达。图2为纯化后的蛋白的进行SDS-PAGE电泳，其中M为蛋白Marker，1为tfPSTBP1。图3为tfPSTBP1的小鼠抗血清ELISA效价测定。图4为tfPSTBP1与TTX的结合动力学图。图5为TTX与蛋白体外孵育灌胃小鼠后的死亡曲线。图6为TTX与蛋白体外孵育腹腔注射小鼠后的死亡曲线。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合附图及具体实施例对本专利技术作进一步详细的描述。本专利技术实施例中所用到的试剂或者仪器，均为本领域技术人员常用的试剂或者仪器。实施例一本专利技术公开了一种河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1，其含有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段。tfPSTBP1开放阅读框编码393个氨基酸，分子量为43.58kDa，预测等电点为5.31。该蛋白属于脂质运载蛋白超级家族的成员。由SignalP-5.0Server在线检测tfPSTBP1蛋白的N端氨基酸序列从残基21开始，tfPSTBP1的前20个氨基酸是信号肽。tfPSTBP1编码的蛋白由信号肽、单结构域和C端最后的9个残基组成。利用BioEdit软件对序列进行多重比对，发现tfPSTBP1的第24-180氨基酸残基与第181-384氨基酸残基为两个重复序列，氨基酸一致性为80.56％。tfPSTBP1含有12个位置保守的半胱氨酸。N-糖基化位点为6个，其中4个是位置保守的。本专利技术公开了河豚毒素结合蛋白(tfPSTBP1)的制备方法，包括以下步骤：S1.构建菊黄东方鲀河豚毒素结合蛋白(tfPSTBP1)的重组表达载体1、菊黄东方鲀河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1基因序列的克隆(1)首先在NCBI数据库中，搜索河豚毒素结合蛋白(PSTB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1，其特征在于：其含有如SEQ ID NO:1所示的氨酸序列的多肽、或其多肽的活性片段。/n

【技术特征摘要】
1.河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1，其特征在于：其含有如SEQIDNO:1所示的氨酸序列的多肽、或其多肽的活性片段。


2.编码权利要求1所述的河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.一种多克隆抗体，其特征在于：采用权利要求1所述的河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1为抗原，免疫小鼠，制备抗血清即得。


4.河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建菊黄东方鲀河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1的重组表达载体；
S2.将重组表达载体导入宿主细胞，对宿主细胞进行诱导表达及条件优化，获得表达产物；
S3.表达产物经过滤，并通过亲和层析柱洗脱，收集洗脱峰即得重组蛋白。


5.如权利要求4所述的河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1的制备方法，其特征在于：
步骤S1中以菊黄东方鲀肝脏制备的总RNA逆转录的cDNA为模版，克隆获得河豚毒素结合蛋白tfPSTBP1的核苷酸序列。


6.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘智禹，黄文树，乔琨，蒋彩云，许旻，陈贝，
申请(专利权)人：福建省水产研究所福建水产病害防治中心，
类型：发明
国别省市：福建;35