用于组织保存的方法和组合物技术

本文描述了保存受试者的组织如脑或其部分的方法。该方法包括通过用包括水性溶液的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织。洗涤液、固定液和/或冷冻保护液可包括染料或造影剂以监控液体通过组织的灌注。在某些实施方式中，冷冻保护液具有约‑80℃或更高的玻璃化温度。洗涤液可进一步包括一种或多种离子通道封阻剂、钙螯合剂、血栓溶解剂、抗血小板药、呼吸毒药或突触毒药。本文还描述了分析保存的组织的方法。

Methods and compositions for tissue preservation

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于组织保存的方法和组合物相关申请的交叉引用本申请要求2017年8月28日提交的美国临时专利申请No.62/550,945的优先权权益，其全部内容通过引用纳入本文。
本文描述的专利技术涉及组织，特别地脑组织保存的方法和组合物(composition)。
技术介绍
固定和保存组织以维持结构的能力对于长期研究中维持临床和科学组织样本很重要。包括来自人类和非人类(如啮齿动物)来源的全脑库(wholebrainbanking)的神经组织，对于研究许多脑疾病如阿尔茨海默氏病(Alzheimer’disease)特别重要。参见，例如Samarasekera等，Brainbankingforneurologicaldisorders，LancetNeurology，第12卷，第11期，第1096页-第1105页(2013)。不幸地，自1960年代以来，脑库技术没有很大变化。人脑通常在持续16-36小时的长时间缺血性延迟后，通常通过浸泡在福尔马林中保存。不幸地，缺血性延迟(血流停滞)、福尔马林固定以及基于缓慢扩散的固定剂渗透的该组合甚至在样本被分析前导致大量的超微结构损坏和蛋白质和/或RNA的损失。保存脑的其他方法包括用醛灌注脑并且在相对温暖的温度(如约4℃)储存固定的脑。然而，由于固定的脑保持化学活性并且能够经历化学和形态学降解，因此该技术不保证长期储存脑的超微结构的静态保存。在零下温度固定的脑的储存用作抑制化学降解，但是冰的形成会导致脑的超微结构显著脱水和机械损坏。最近开发的被称为醛稳定化冷冻保存(ASC)的用于动物脑的保存的技术，有望大大提高保存脑的保存质量和储存时间。参见McIntyre&Fahy，Aldehyde-stabilizedcryopreservation(醛稳定化冷冻保存)，Cryobiology，第71卷，第448页-第458页(2015)。ASC通过灌注递送戊二醛，使得能够快速固定所有的脑结构。然后引入冷冻保护剂，使得能够在非常低的温度长期储存。ASC方法仍然有许多缺陷，包括结构质量、储存温度和质量控制。例如，用固定液灌注组织可导致肌肉或组织收缩或水肿，其限制液体灌注到毛细血管床中。另外，使用ASC方法保存可导致细胞外空间的损失、锚定的神经递质囊泡的损失、髓磷脂的释放(unraveling)、细胞骨架的重组和整体组织皱缩。本文所涉及的所有出版物、专利和专利申请的公开内容均通过引用方式全部纳入本文。
技术实现思路
本文描述了保存组织(如脑)的方法以及分析保存的组织的方法。本文还描述了可以用于保存组织的洗涤液(washfluid)、固定液和冷冻保护液。在一个方面中，保存受试者组织的方法包括：通过用包括水性液体(如盐水(saline)或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织；其中洗涤液、固定液或冷冻保护液包括染料或造影剂。在另一个方面中，保存受试者组织的方法包括：通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织，冷冻保护液具有约-80℃或更高的玻璃化温度。在另一个方面中，保存受试者组织的方法包括：通过用包括(1)水性液体(如盐水或缓冲盐水)和(2)离子通道封阻剂、钙螯合剂、血栓溶解剂、抗血小板药、呼吸毒药或突触毒药中的任何一种或多种的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织。在另一个方面中，保存受试者组织的方法包括：通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保存组织；其中在组织中缺血发作后开始洗涤。在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液、固定液或冷冻保护液包括染料或造影剂。在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液、固定液或冷冻保护液包括不透射线染料。在上述的方法的一些实施方式中，方法进一步通过使在组织中洗涤液、固定液或冷冻保护液的分布成像进行监控。在另一个方面中，保存受试者组织的方法包括通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织；以及通过使在组织中洗涤液、固定液或冷冻保护液的分布成像进行监控。在上述的方法的一些实施方式中，通过计算机断层扫描(CT)、微计算机断层扫描(microCT)、X-射线或磁共振成像(MRI)进行监控。在上述的方法的一些实施方式中，根据灌注方案进行用洗涤液、固定液或冷冻保护液灌注组织，其中灌注方案基于监控的洗涤液、固定液或冷冻保护液的分布进行改进。在上述的方法的一些实施方式中，方法进一步包括使组织玻璃化。在一些实施方式中，组织被玻璃化至约-100℃或更冷的温度。在一些实施方式中，方法包括储存玻璃化的组织约72小时或更长。在一些实施方式中，方法包括解冻玻璃化的组织。在上述的方法的一些实施方式中，方法包括使保存的组织的至少一部分成像。在上述的方法的一些实施方式中，方法包括通过显微解剖学分析表征保存的组织的至少一部分。在上述的方法的一些实施方式中，使用电子显微镜、扩展显微镜(expansionmicroscopy)或荧光原位杂交(FISH)扩展显微镜使保存的组织的至少一部分成像。在本文提供的一个方面中，分析来自受试者的保存的组织的方法包括使保存的组织成像或对保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已通过以下被保存：通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织；以及监控在组织的灌注期间洗涤液、固定液或冷冻保护液的分布。在本文提供的另一个方面中，分析来自受试者的保存的组织的方法包括使保存的组织成像或对保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已经通过以下被保存：通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织，冷冻保护液具有约-80℃或更高的玻璃化温度。在本文提供的另一个方面中，分析来自受试者的保存的组织的方法包括使保存的组织成像或对保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已经通过以下被保存：通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)、离子通道封阻剂、钙螯合剂、血栓溶解剂、呼吸毒药、突触毒药和血管舒张药的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织。在上述的方法的一些实施方式中，在组织的灌注期间监控组织中洗涤液、固定液或冷冻保护液的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种保存受试者的组织的方法，其包括：/n通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；/n通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及/n通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织；/n其中在所述组织中缺血发作后开始所述洗涤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170828 US 62/550,9451.一种保存受试者的组织的方法，其包括：
通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；
通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及
通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织；
其中在所述组织中缺血发作后开始所述洗涤。


2.一种保存受试者的组织的方法，其包括：
通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；
通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及
通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织，所述冷冻保护液具有约-80℃或更高的玻璃化温度。


3.一种保存受试者的组织的方法，其包括：
通过用包括(1)水性溶液和(2)离子通道封阻剂、钙螯合剂、血栓溶解剂、抗血小板药、呼吸毒药或突触毒药中的任何一种或多种的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；
通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及
通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括染料或造影剂。


5.一种保存受试者的组织的方法，其包括：
通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；
通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及
通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织；
其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括染料或造影剂。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括不透射线染料。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，进一步包括通过使在所述组织中的所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液的分布成像进行监控。


8.一种保存受试者的组织的方法，其包括：
通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；
通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；
通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织；以及
通过使在所述组织中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液的分布成像进行监控。


9.根据权利要求7或8所述的方法，其中通过计算机断层扫描(CT)、微计算机断层扫描(microCT)、X-射线或MRI进行所述监控。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中根据灌注方案进行用所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液灌注所述组织，其中所述灌注方案基于监控的所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液的分布改进。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，进一步包括玻璃化所述组织。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述组织被玻璃化至约-100℃或更冷的温度。


13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其包括储存玻璃化的组织约72小时或更长。


14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其包括解冻玻璃化的组织。


15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其包括使保存的组织的至少一部分成像。


16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其包括通过显微解剖学分析表征保存的组织的至少一部分。


17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中保存的组织的至少一部分使用电子显微镜、扩展显微镜或荧光原位杂交(FISH)扩展显微镜成像。


18.一种分析来自受试者的保存的组织的方法，其包括使所述保存的组织成像或对所述保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已通过以下被保存：
通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；
通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；
通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织；以及
监控在所述组织的灌注期间所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液的分布。


19.一种分析来自受试者的保存的组织的方法，其包括使所述保存的组织成像或对所述保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已通过以下被保存：
通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；
通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及
通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织，所述冷冻保护液具有约-80℃或更高的玻璃化温度。


20.一种分析来自受试者的保存的组织的方法，其包括使所述保存的组织成像或对所述保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已通过以下被保存：
通过用包括(1)水性溶液和(2)离子通道封阻剂、钙螯合剂、血栓溶解剂、抗血小板药、呼吸毒药或突触毒药中的任何一种或多种的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；
通过用包括醛的固定液灌注所述组...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·麦金太尔，M·麦卡纳，
申请(专利权)人：福姆六二有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US