一种玻璃化冷冻液及其生产方法技术

本发明专利技术提供了一种玻璃化冷冻液，包括玻璃化冷冻ES液和玻璃化冷冻VS液；所述玻璃化冷冻ES液和玻璃化冷冻VS液均包括非渗透性保护剂，渗透性保护剂，离子基础剂，能量基础剂，营养剂，缓冲剂，指示剂，pH调节剂，抗菌剂份和纯化水。本发明专利技术的玻璃化冷冻液可用于快速高效的冻存胚胎细胞，且由于本发明专利技术添加了复合氨基酸且把冻存液的内毒素控制在了0.1EU一下，能大大减小冻存对细胞的损伤及毒性提高细胞的复苏活率。同时，本发明专利技术提供了玻璃化冷冻液大规模生产的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种玻璃化冷冻液及其生产方法
本专利技术涉及细胞保存领域，具体涉及一种玻璃化冷冻液及其生产方法。
技术介绍
在超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-170℃的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。水在低于零度的条件下会结冰，如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先冻结，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损伤，细胞膜通透性增加，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都发生冻结，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，通常以很快的速度升温，在最短的时间内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。玻璃化冷冻法的基本原理是将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下冻结，形成玻璃化状态，保存了液态时正常分子和离子分布，因而玻璃化可以对细胞产生保护作用。所保存细胞在冷冻保护剂中脱水到一定程度后，则引起内源性胞质大分子如蛋白质及渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，从而使细胞在剧烈的快速降温中得到保护。配子和胚胎的冷冻保存已经是辅助生殖领域中一个必要的部分。在过去这二十年中，冷冻保存技术的发展亦可反映辅助生殖技术的发展程度，现在的冷冻技术已用于冷冻保存精子、卵子和不同时期的胚胎，尤其是玻璃化冷冻技术(Vitrification)，不仅获得医学界广泛的认可，并逐渐取代传统慢术冷冻法，而成为冷冻保存技术的最佳选择，并且在卵子、卵巢组织和人类胚胎干细胞的冷冻保存方面也显示出巨大的作用。有别于慢速冷冻法在降温的冷冻过程中会产生冰晶，进而造成胚胎的损伤，玻璃化冷冻技术的特点就是使细胞本身及冷冻溶液在降温过程中，形成黏稠而不产生结晶的玻璃化状态，利用这个特点可以避免慢速冷冻中存在的缺陷。换言之，胚胎的冷冻保存与复苏的成功与否，不单与胚胎质量有关，同时也需要在冷冻保存过程中避免冰晶形成。而玻璃化冷冻过程中，细胞与高浓度冷冻保护剂经一定时间平衡后，细胞体积可因脱水而减少30-50％，将细胞加载与适当的冷冻载体上并直接投入液态氮中使细胞瞬间发生玻璃化，到达长期保存的目的。有别于其他除内毒素的方法，其他冻存液内毒素一般控制在1EU一下，本冻存液的内毒素控制在0.1EU以下，由于内毒素对于细胞有很大的毒性，因此本冻存液的低内毒素可以大大降低内毒素对细胞的毒性，从而提高细胞复苏活率以及减低胚胎的致畸率。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提供出一种玻璃化冷冻液及其生产方法，该玻璃化冷冻液具有快速冷冻生殖细胞的作用，同时由于加了复合氨基酸且控制冻存液的超低内毒素，能大大减小冻存对细胞的损伤及毒性，提高细胞的复苏活率以及降低胚胎细胞的致畸率，可用于胚胎细胞的玻璃化冷冻，生产方法简洁、高效。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种玻璃化冷冻液，包括玻璃化冷冻ES液和玻璃化冷冻VS液；所述玻璃化冷冻ES液包括如下重量份的组分：非渗透性保护剂0.3-0.7份，渗透性保护剂10-20份，离子基础剂0.2-1.0份，能量基础剂0.01-1份，营养剂0.001-0.1份，缓冲剂0.1-1.0份，指示剂0.0001-0.1份，pH调节剂0.001-1.0份，抗菌剂0.0001-0.1份和纯化水80.0-90.0份；所述玻璃化冷冻VS液包括如下重量份的组分：非渗透性保护剂5.0-10.0份，渗透性保护剂20.0-40.0份，离子基础剂0.2-1.0份，能量基础剂0.01-1份，营养剂0.001-0.1份，缓冲剂0.1-1.0份，指示剂0.0001-0.1份，pH调节剂0.001-1.0份，抗菌剂0.0001-0.1份和纯化水55.0-70.0份。进一步，所述非渗透性保护剂为蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、葡聚糖、羟乙基淀粉、半乳糖或人血清白蛋白(包括人血源，发酵及植物源)中的一种或两种以上；优选地，所述非渗透性保护剂为蔗糖和/或人血清白蛋白；优选地，所述玻璃化冷冻ES液的非渗透性保护剂包括人血清白蛋白0.3-0.7份；优选为植物源重组人血清白蛋白0.3-0.7份，更优选为0.4份。优选地，所述玻璃化冷冻VS液的非渗透性保护剂包括人血清白蛋白0.3-0.7份，蔗糖4.0-9.0份。人血清白蛋白优选为植物源重组人血清白蛋白0.3-0.7份，更优选为0.3份。在本专利技术中，玻璃化冷冻液用载体装载，对其不作严格限制，例如可以采用冻存管、离心管、西林瓶等，优选为无菌无热原的冻存管；此外，对载体的容量及尺寸不作严格限制，载体容量可以为：1ml、2ml、5ml等。在本专利技术中，非渗透性保护剂属大分子物质，不能穿透细胞；细胞冷冻时在冰晶形成之前，优先结合溶液中水分子，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量，从而减轻溶质损伤。研究发现，人血清白蛋白(CAS：70024-90-7)，除了能表现出非渗透性保护剂的一般作用外，还能降低其它组分对细胞的毒害作用。在本专利技术中，对其余非渗透性保护剂不作严格限制，例如可以选自蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、葡聚糖、羟乙基淀粉、半乳糖中的至少一种，优选为蔗糖。具体地，蔗糖(CAS：57-50-1)又称为α-d-吡喃葡萄糖基β-d-呋喃果糖、β-d-呋喃果糖(2-1)-α-d-吡喃葡萄糖苷等，其没有毒性，能够降低细胞内溶剂的浓度来加强细胞内脱水，进而避免细胞发生肿胀破裂现象。进一步，所述渗透性保护剂为二甲基亚砜、乙酰胺、甲醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、丙三醇中的一种或两种以上；优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玻璃化冷冻液，其特征在于：包括玻璃化冷冻ES液和玻璃化冷冻VS液；/n所述玻璃化冷冻ES液包括如下重量份的组分：非渗透性保护剂0.3-0.7份，渗透性保护剂10-20份，离子基础剂0.2-1.0份，能量基础剂0.01-1份，营养剂0.001-0.1份，缓冲剂0.1-1.0份，指示剂0.0001-0.1份，pH调节剂0.001-1.0份，抗菌剂0.0001-0.1份和纯化水80.0-90.0份；/n所述玻璃化冷冻VS液包括如下重量份的组分：非渗透性保护剂5.0-10.0份，渗透性保护剂20.0-40.0份，离子基础剂0.2-1.0份，能量基础剂0.01-1份，营养剂0.001-0.1份，缓冲剂0.1-1.0份，指示剂0.0001-0.1份，pH调节剂0.001-1.0份，抗菌剂0.0001-0.1份和纯化水55.0-70.0份。/n

【技术特征摘要】
1.一种玻璃化冷冻液，其特征在于：包括玻璃化冷冻ES液和玻璃化冷冻VS液；
所述玻璃化冷冻ES液包括如下重量份的组分：非渗透性保护剂0.3-0.7份，渗透性保护剂10-20份，离子基础剂0.2-1.0份，能量基础剂0.01-1份，营养剂0.001-0.1份，缓冲剂0.1-1.0份，指示剂0.0001-0.1份，pH调节剂0.001-1.0份，抗菌剂0.0001-0.1份和纯化水80.0-90.0份；
所述玻璃化冷冻VS液包括如下重量份的组分：非渗透性保护剂5.0-10.0份，渗透性保护剂20.0-40.0份，离子基础剂0.2-1.0份，能量基础剂0.01-1份，营养剂0.001-0.1份，缓冲剂0.1-1.0份，指示剂0.0001-0.1份，pH调节剂0.001-1.0份，抗菌剂0.0001-0.1份和纯化水55.0-70.0份。


2.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻液，其特征在于：所述非渗透性保护剂为蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、葡聚糖、羟乙基淀粉、半乳糖或人血清白蛋白中的一种或两种以上；优选地，所述非渗透性保护剂为蔗糖和/或人血清白蛋白；
优选地，所述玻璃化冷冻ES液的非渗透性保护剂包括人血清白蛋白0.3-0.7份；
优选地，所述玻璃化冷冻VS液的非渗透性保护剂包括人血清白蛋白0.3-0.7份，蔗糖4.0-9.0份。


3.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻液，其特征在于：所述渗透性保护剂为二甲基亚砜、乙酰胺、甲醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、丙三醇中的一种或两种以上；优选地，所述渗透性保护剂为二甲基亚砜和/或乙二醇；
优选地，所述玻璃化冷冻ES液的渗透性保护剂包括二甲基亚砜5.0-10.0份，乙二醇5.0-10.0份；
优选地，所述玻璃化冷冻VS液的渗透性保护剂包括二甲基亚砜10.0-20.0份，乙二醇10.0-20.0份。


4.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻液，其特征在于：所述离子基础剂包括第一基础离子剂、第二基础离子剂、第三基础离子剂和第四基础离子剂；
所述第一基础离子剂为氯化钠、硫酸钠中的一种或两种，优选地，第一基础离子剂为氯化钠；
所述第二基础离子剂为氯化钾、硫酸钾中的一种或两种，优选地，第二基础离子剂为氯化钾；
所述第三基础离子剂为氯化镁、硫酸镁中的一种或两种，优选地，第三基础离子剂为硫酸镁；
所述第四基础离子剂为氯化钙；
优选地，所述玻璃化冷冻ES液的离子基础剂包括氯化钠0.1-0.6份，氯化钾0.02-0.1份，氯化钙0.01-0.1份，硫酸镁0.001-0.1份；
优选地，所述玻璃化冷冻VS液的离子基础剂包括氯化钠0.1-0.6份，氯化钾0.02-0.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：芮宝锋，刘宇，张路，孙颖，孙爱平，
申请(专利权)人：爱科天津生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12