受约束的条件性活化的结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及以活性前药形式施用的条件性双特异性重定向的活化构建体或COBRA。在暴露于肿瘤蛋白酶后，所述构建体被裂解并被活化，这样它们能够结合肿瘤靶抗原(TTA)以及CD3两者，由此将表达CD3的T细胞募集至肿瘤，从而进行治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】受约束的条件性活化的结合蛋白I.相关申请的交叉引用本申请根据美国法典第35篇119条(e)款要求2017年9月8日提交的美国临时专利申请62/555,943、2017年11月15日提交的美国临时专利申请62/586,627和2017年11月16日提交的美国临时专利申请62/587,318的优先权，所述临时专利申请全部明确地以引用的方式整体并入本文。II.对在压缩光盘上提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附件的引用。名称为“118459-5005_ST25.txt”、大小为984千字节的文件中包含的序列表已经由EFS-Web与本文一起以电子方式提交，并且所述txt文件的内容特此以引用的方式整体并入。III.专利技术背景在各种临床环境中，通常需要选择性破坏单独细胞或特定细胞类型。例如，癌症疗法的主要目标是特异性地破坏肿瘤细胞，同时使健康的细胞和组织尽可能完整无损。一种这样的方法是通过诱导针对肿瘤的免疫应答以使诸如自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的免疫效应细胞攻击并破坏肿瘤细胞来进行。完整单克隆抗体(mAb)(其为肿瘤相关抗原提供优异的结合特异性和亲和力)的使用已成功应用于癌症治疗和诊断领域。但是，完整mAb的大尺寸、它们的较差生物分布、低效力以及在血池中持久存在限制了它们的临床应用。例如，完整抗体可在肿瘤区域内表现出特异性累积。在生物分布研究中，当精确检查肿瘤时，注意到抗体分布不均匀，主要累积在外周区域中。由于肿瘤坏死、不均匀的抗原分布和增加的间质组织压力，不可能以完整抗体构建体到达肿瘤的中心部分。相比之下，较小的抗体片段显示出快速的肿瘤定位，更深地渗透到肿瘤中并且也相对快速地从血流中清除。然而，许多抗体(包括scFv和其他构建体)显示出“中靶/脱肿瘤(ontarget/offtumor)”效应，其中分子在非肿瘤细胞上具有活性，从而引起副作用，所述副作用中的一些可能是毒性副作用。本专利技术涉及在肿瘤蛋白酶存在下选择性地活化的新型构建体。IV.
技术实现思路
本专利技术提供了许多用于治疗癌症的不同蛋白质组合物。因此，在一方面，本专利技术提供了“形式2”蛋白质，所述形式2蛋白质从N-末端至C-末端包含：结合至人肿瘤靶抗原(TTA)的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)(sdABD-TTA)；b)第一结构域接头；c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；ii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；和iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；d)第二结构域接头；e)第二sdABD-TTA；f)可裂解的接头(CL)；g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：i)第一伪轻可变结构域；ii)不可裂解的接头(NCL)；和iii)第一伪重可变结构域；h)第三结构域接头；以及i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。在进一步的方面，本专利技术提供了“形式1”蛋白质，所述形式1蛋白质从N-末端至C-末端包含：a)第一sdABD-TTA；b)第一结构域接头；c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；ii)受约束的可裂解的接头(CCL)；和iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；d)第二结构域接头；e)第二sdABD-TTA；f)可裂解的接头(CL)；g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：i)第一伪轻可变结构域；ii)不可裂解的接头(NCL)；和iii)第一伪重可变结构域；h)第三结构域接头；以及i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；其中所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且其中所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。在另外的方面，本专利技术提供了“形式4”蛋白质，所述“形式4”蛋白质从N-末端至C-末端包含：a)结合至人肿瘤靶抗原(TTA)的单结构域抗原结合结构域(sdABD)(sdABD-TTA)；b)第一结构域接头；c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；ii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；和iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；d)可裂解的接头(CL)；e)结合至人血清白蛋白的第二sdABD；f)结构域接头；g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：i)第一伪轻可变结构域；ii)不可裂解的接头(NCL)；和iii)第一伪重可变结构域；其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；其中所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且其中所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。在上文列出的形式1、形式2和形式4蛋白质的进一步方面，所述第一可变重结构域在所述第一可变轻结构域的N-末端，并且所述伪轻可变结构域在所述伪可变重结构域的N-末端。在上文列出的形式1、形式2和形式4蛋白质的进一步方面，所述第一可变重结构域在所述第一可变轻结构域的N-末端，并且所述伪可变重结构域在所述伪可变轻结构域的N-末端。在上文列出的形式1、形式2和形式4蛋白质的进一步方面，所述第一可变轻结构域在所述第一可变重结构域的N-末端，并且所述伪轻可变结构域在所述伪可变重结构域的N-末端。在上文列出的形式1、形式2和形式4蛋白质的进一步方面，所述第一可变轻结构域在所述第一可变重结构域的N-末端，并且所述伪可变重结构域在所述伪可变轻结构域的N-末端。在另外的方面，本专利技术提供了形式1和形式2蛋白质，其中所述第一和第二TTA是相同的。在进一步的方面，本专利技术提供了形式1和形式2蛋白质，其中所述第一和第二TTA是不同的。在另外的方面，本专利技术提供了形式1、形式2和形式4蛋白质，其中所述第一和第二TTA选自EGFR、EpCAM、FOLR1和B7H3。这些序列可选自由以下组成的组：SEQIDNO:1、SEQIDNO:5、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:33、SEQIDNO:37以及SEQIDNO:41。在进一步的方面，本专利技术提供了形式1、形式2和形式4蛋白质，其中所述半衰期延长结构域具有SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，所述蛋白质从N-末端至C-末端包含：/na)结合至人肿瘤靶抗原(TTA)的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)(sdABD-TTA)；/nb)第一结构域接头；/nc)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：/ni)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；/nii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；以及/niii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；/nd)第二结构域接头；/ne)第二sdABD-TTA；/nf)可裂解的接头(CL)；/ng)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：/ni)第一伪轻可变结构域；/nii)不可裂解的接头(NCL)；以及/niii)第一伪重可变结构域；/nh)第三结构域接头；以及/ni)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；/n其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；其中所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且其中所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170908 US 62/555,943;20171115 US 62/586,627;20171.一种蛋白质，所述蛋白质从N-末端至C-末端包含：
a)结合至人肿瘤靶抗原(TTA)的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)(sdABD-TTA)；
b)第一结构域接头；
c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：
i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；
ii)受约束的不可裂解的接头(CNCL)；以及
iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；
d)第二结构域接头；
e)第二sdABD-TTA；
f)可裂解的接头(CL)；
g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：
i)第一伪轻可变结构域；
ii)不可裂解的接头(NCL)；以及
iii)第一伪重可变结构域；
h)第三结构域接头；以及
i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；
其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；其中所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且其中所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。


2.一种蛋白质，所述蛋白质从N-末端至C-末端包含：
a)第一sdABD-TTA；
b)第一结构域接头；
c)受约束的Fv结构域，所述受约束的Fv结构域包含：
i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重结构域；
ii)受约束的可裂解的接头(CCL)；以及
iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻结构域；
d)第二结构域接头；
e)第二sdABD-TTA；
f)可裂解的接头(CL)；
g)受约束的伪Fv结构域，所述受约束的伪Fv结构域包含：
i)第一伪重可变结构域；
ii)不可裂解的接头(NCL)；以及
iii)第一伪轻可变结构域；
h)第三结构域接头；以及
i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；
其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域能够结合人CD3，但所述受约束的Fv结构域不结合CD3；其中所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子内缔合以形成无活性的Fv；并且其中所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子内缔合以形成无活性的Fv。


3.根据权利要求1至2中任一项所述的蛋白质，其中所述第一可变重结构域在所述第一可变轻结构域的N-末端，并且所述伪轻可变结构域在所述伪可变重结构域的N-末端。


4.根据权利要求1至2中任一项所述的蛋白质，其中所述第一可变重结构域在所述第一可变轻结构域的N-末端，并且所述伪可变重结构域在所述伪可变轻结构域的N-末端。


5.根据权利要求1至2中任一项所述的蛋白质，其中所述第一可变轻结构域在所述第一可变重结构域的N-末端，并且所述伪轻可变结构域在所述伪可变重结构域的N-末端。


6.根据权利要求1至2中任一项所述的蛋白质，其中所述第一可变轻结构域在所述第一可变重结构域的N-末端，并且所述伪可变重结构域在所述伪可变轻结构域的N-末端。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白质，其中所述第一TTA和所述第二TTA是相同的。


8.根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白质，其中所述第一TTA和所述第二TTA是不同的。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白质，其中所述第一TTA和所述第二TTA选自EGFR、EpCAM、FOLR1和B7H3。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的蛋白质，其中所述第一sdABD-TTA和所述第二sdABD-TTA选自由以下组成的组：SEQIDNO:1、SEQIDNO:5、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:33、SEQIDNO:37以及SEQIDNO:41。


11.根据权利要求1至10所述的蛋白质，其中所述半衰期延长结构域具有SEQIDNO:45。


12.根据权利要求1至11所述的蛋白质，其中所述可裂解的接头被选自由以下组成的组的人蛋白酶裂解：MMP2、MMP9、穿膜肽酶A、穿膜肽酶B、组织蛋白酶S、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、颗粒酶B、uPA、激肽释放酶7、蛋白裂解酶和凝血酶。


13.根据权利要求1所述的蛋白质，所述蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Pro186、Pro225、Pro226、Pro233、Pro311、Pro312、Pro313、Pro495、Pro246、Pro254、Pro255、Pro256、Pro420、Pro421、Pro432、Pro479、Pro480、Pro187、Pro221、Pro222、Pro223、Pro224、Pro393、Pro394、Pro395、Pro396、Pro429、Pro430以及Pro431。


14.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1至13中任一项所述的蛋白质。


15.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求14所述的核酸。


16.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求15所述的表达载体。


17.一种制备蛋白质的方法，所述方法包括在所述蛋白质被表达的条件下培养如权利要求16所述的宿主细胞以及回收所述蛋白质。


18.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用如权利要求1至13中任一项所述的蛋白质。


19.一种组合物，所述组合物包含：
a)第一蛋白质，所述第一蛋白质从N-末端至C-末端包含：
i)第一sdABD-TTA；
ii)第一结构域接头；
iii)伪Fv结构域，所述伪Fv结构域从N-末端至C-末端包含：
1)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；
2)可裂解的接头；以及
3)包含iVLCDR1、iVLCDR2和iVLCDR3的第一伪可变轻结构域；
iv)第二结构域接头；
v)结合至人血清白蛋白的第一sdABD；
a)第二蛋白质，所述第二蛋白质从N-末端至C-末端包含：
i)结合至人肿瘤靶抗原的第三sdABD；
ii)第三结构域接头；
iii)伪Fv结构域，所述伪Fv结构域从N-末端至C-末端包含：
1)包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的可变轻链；
2)可裂解的接头；以及
3)包含iVHCDR1、iVHCDR2和iVHCDR3的第一伪可变重结构域；
iv)第四结构域接头；
v)结合至人血清白蛋白的第四sdABD；
其中
所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域能够在缔合时结合人CD3；
所述第一可变重结构域和所述第一伪可变轻结构域分子间缔合以形成无活性的Fv；
所述第一可变轻结构域和所述第一伪可变重结构域分子间缔合以形成无活性的Fv；
其中所述第一sdABD和所述第三sdABD选自由以下组成的组：SEQIDNO:1、SEQIDNO:5、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:33、SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·梅，R·B·杜布里奇，M·维诺格拉多沃娃，A·潘沙尔，
申请(专利权)人：马弗里克治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US