一种长链二元酸的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种长链二元酸的制备方法，其解决了现有发酵方法制备长链二元酸存在高成本、低转化率和低产量的技术问题，其包含以下步骤：(1)取含有冻存菌株的甘油种子管，接种在装有培养基的摇瓶中，获得种子液，将种子液放入装有一级种子培养基的摇瓶中，制得一级种子液；(2)将一级种子液放入装有二级种子培养基的要瓶中，制得二级种子液；(3)调节发酵液的pH 4～6，设置发酵所需的搅拌转速、温度和通气量，将二级种子液放入装有发酵培养基的发酵罐中，补入葡萄糖，调节pH值至6.8～7.2，进行补料发酵，调节pH值至7.3～7.6，直至发酵结束，制得长链二元酸。本发明专利技术可广泛应用于长链二元酸制备领域。

A preparation method of long chain dicarboxylic acid

【技术实现步骤摘要】
一种长链二元酸的制备方法
本专利技术涉及生物化工领域，具体地说是一种长链二元酸的制备方法。
技术介绍
长链二元酸可用来合成工程塑料、人造尼龙、润滑油、洗涤剂、乳化剂、人造麝香、热熔胶、耐寒性增塑剂、树脂等，广泛应用于工业、农业和医药卫生等行业。二元酸的生产，最初是由化学法合成的，其合成步骤繁琐，且需要高温高压，条件要求苛刻；而且化学合成法无法合成较长碳链的二元酸。发酵法合成长链二元酸是由70年代兴起的，其反应条件温和，反应专一性强且原料来源广，所以发酵法生产长链二元酸在国内外普遍受到重视。目前国内外生产长链二元酸的技术专利主要以烷烃和脂肪酸衍生物为底物发酵生产长链二元酸，而烷烃是由从石油中得到的，属不可再生资源，而且价格浮动较大；从动植物组织中提取的初产品需要经过加工才能得到脂肪酸衍生物，虽属可再生资源但价格较贵。使用烷烃和脂肪酸衍生物做底物生产二元酸利润太低。而长链脂肪酸和脂肪醇价格较脂肪酸衍生物便宜，但长链脂肪酸和脂肪醇的熔点较高，在常温下为固体或易结晶，不方便流加。申请号为201110168672.X的中国专利技术专利申请中公开了将烷烃、脂肪酸和脂肪酸衍生物转化为相应的二元酸的方法，但其试验处于摇瓶阶段，而且实施例中未提到将脂肪酸转化为长链二元酸方法。申请号为200410018255.7的中国专利技术专利申请，公开了将油酸转化为DC18的方法。但是油酸本身为不饱和脂肪酸，常温下为液体，不存在补料的问题。而且其产品为不饱和长链二元酸，与本专利所述饱和长链二元酸属性质完全不同的产品。由于发酵过程中气泡严重，发酵无法正常进行，目前尚无实际采用月桂醇(十二碳饱和脂肪醇)作为原料发酵生产月桂二酸(十二碳饱和二元羧酸)的实例。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决现有发酵方法制备长链二元酸存在高成本、低转化率和低产量的技术问题，提供一种新的可再生原料发酵生产长链二元酸的制备方法。本专利技术发酵法中所用的菌株为假丝酵母，分类命名为假丝酵母(Candidasp.)TDTC002；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号10院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2014年3月18日，保藏号编号为：CGMCCNo.8927。上述菌株已记载在专利号为201410175548.X、公开号为CN105018357B的中国专利技术专利说明书中。为此，本专利技术提供一种长链二元酸的制备方法，具体包含以下步骤：(1)一级种子液的制备：取含有冻存菌株的甘油种子管，接种在装有培养基的摇瓶中，培养12～24h，获得种子液，将种子液放入装有一级种子培养基的摇瓶中，培养6～20h，制得一级种子液；(2)二级种子液的制备：将步骤(1)制得的一级种子液放入装有二级种子培养基的摇瓶中，培养8～24h，制得二级种子液；(3)补料发酵：调节发酵液的pH4～6，设置发酵所需的搅拌转速、温度和通气量，将步骤(2)制得的二级种子液放入装有发酵培养基的发酵罐中，补入葡萄糖，调节pH值至6.8～7.2，进行补料发酵，调节pH值至7.3～7.6，直至发酵结束，制得长链二元酸。优选地，步骤(1)中，一级种子培养基的组分为5～12g/LKH2PO4，4～12g/L蔗糖，1～10g/L酵母膏，1～4g/L尿素，0～40ml/L重蜡油；步骤(2)中，二级种子培养基的组分为5～12g/LKH2PO4，4～12g/L蔗糖，1～10g/L酵母膏，1～4g/L尿素，0～50ml/L重蜡油；步骤(3)中，发酵培养基的组分为6～12g/LKH2PO4，5～15g/L蔗糖，1～10g/L酵母膏，1～5g/L尿素，5～50g/L玉米浆，0～5g/LNaCl，4～14g/LKNO3，1～5g/L吐温60，0.1％～5％消泡剂。优选地，步骤(3)中，搅拌转速为300～750rpm，温度为29℃～31℃，通气量为0.5～2VVM。优选地，步骤(3)中，补料发酵为月桂醇和乙醇的混合溶液发酵或月桂醇发酵。优选地，步骤(3)中，补料发酵时，18h～24h时补料速度4ml～7ml/h，24h～30h补料速度为1ml～5ml/h，30h～50h补料速度为7ml～15ml/h，50h～100h补料速度为4ml～8ml/h，100h～166h补料速度为2ml～5ml/h。优选地，步骤(3)补料发酵的总时长为116h～186h，发酵结束前5～20h，停止补料。优选地，步骤(3)中进行补料发酵时，需要进行补料停顿，停顿的次数为1～4次，停顿的时长为0.2h～3h。优选地，长链二元酸为十二碳以上的二元酸。优选地，月桂醇为液态，补料方式为流加方式。优选地，乙醇溶液与月桂醇的体积比为1:7。本专利技术的有益性：(1)本专利技术以月桂醇为底物进行发酵转化，月桂醇的熔点为24℃，温度较低时月桂醇易结晶，月桂醇在流加过程中极易产生肥皂样泡沫，所有已知消泡剂均无消泡作用。因此，本专利技术采用新菌种假丝酵母Candidasp.CGMCC8927优化了底物状态，通过调节补料速度和pH值，进而完成对月桂醇的流加，并使产酸浓度在115h时大于120g/kg，转化率达到70％。(2)以月桂醇和乙醇溶液的混合溶液作为原料补料发酵，当月桂醇：乙醇＝7：1时，可以有效地控制起泡，完成发酵。实验证明，70小时以后不再起泡，补料速度均一。(3)熔点以上保持液态的月桂醇作为原料补料发酵时，调节补料速率，也可以控制起泡，完成发酵。实验证明，80小时以后不再起泡，补料速度均一。附图说明图1为本专利技术实施例1中的补料速率；图2为本专利技术实施例2中的补料速率；图3为本专利技术实施例3中的补料速率。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本专利技术。实施例1(1)一级种子液的制备：取冻存的CGMCC8927菌株的甘油冻存管(种子管)，接种在装有50mlYPD培养基(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L)的500ml摇瓶中，至于30℃，250rpm的摇床培养18h，将上述摇好的种子液，接5ml进入装有50ml一级种子培养基(KH2PO45g/L，蔗糖4g/L，酵母膏1g/L，尿素1g/L，重蜡油40ml/L，115℃灭菌30min)的500ml摇瓶中，至于30℃，250rpm的摇床培养6h；(2)二级种子液的制备：将摇好的一级种子，接10ml进入装有40ml二级种子培养基(KH2PO412g/L，蔗糖12g/L，酵母膏10g/L，尿素4g/L，重蜡油50ml/L，115℃灭菌30min)的500ml摇瓶中，至于30℃，250rpm的摇床培养24h，制得二级种子液。(3)月桂醇和乙醇的混合溶液为原料补料发酵：将制好的二级种子液接200ml于装本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长链二元酸的制备方法，其特征是，包含以下步骤：/n(1)一级种子液的制备：取含有冻存菌株的甘油种子管，接种在装有培养基的摇瓶中，培养12～24h，获得种子液，将所述种子液放入装有一级种子培养基的摇瓶中，培养6～20h，制得一级种子液；/n(2)二级种子液的制备：将所述步骤(1)制得的一级种子液放入装有二级种子培养基的要瓶中，培养8～24h，制得二级种子液；/n(3)补料发酵：调节发酵液的pH 4～6，设置发酵所需的搅拌转速、温度和通气量，将所述步骤(2)制得的二级种子液放入装有发酵培养基的发酵罐中，补入葡萄糖，调节pH值至6.8～7.2，进行补料发酵，调节pH值至7.3～7.6，直至发酵结束，制得长链二元酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种长链二元酸的制备方法，其特征是，包含以下步骤：
(1)一级种子液的制备：取含有冻存菌株的甘油种子管，接种在装有培养基的摇瓶中，培养12～24h，获得种子液，将所述种子液放入装有一级种子培养基的摇瓶中，培养6～20h，制得一级种子液；
(2)二级种子液的制备：将所述步骤(1)制得的一级种子液放入装有二级种子培养基的要瓶中，培养8～24h，制得二级种子液；
(3)补料发酵：调节发酵液的pH4～6，设置发酵所需的搅拌转速、温度和通气量，将所述步骤(2)制得的二级种子液放入装有发酵培养基的发酵罐中，补入葡萄糖，调节pH值至6.8～7.2，进行补料发酵，调节pH值至7.3～7.6，直至发酵结束，制得长链二元酸。


2.根据权利要求1所述的长链二元酸的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述一级种子培养基的组分为5～12g/LKH2PO4，4～12g/L蔗糖，1～10g/L酵母膏，1～4g/L尿素，0～40ml/L重蜡油；
步骤(2)中，所述二级种子培养基的组分为5～12g/LKH2PO4，4～12g/L蔗糖，1～10g/L酵母膏，1～4g/L尿素，0～50ml/L重蜡油；
步骤(3)中，所述发酵培养基的组分为6～12g/LKH2PO4，5～15g/L蔗糖，1～10g/L酵母膏，1～5g/L尿素，5～50g/L玉米浆，0～5g/LNaCl，4～14g/LKNO3，1～5g/L吐温60，0.1％～5％消泡剂。


3.根据权利要求1所述的长链二元酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏毅，晏礼明，赖小勤，杨勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11