一种光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法技术

一种光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，属于纳米材料和生命科学领域。本发明专利技术利用青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇和烟草花叶病毒衣壳蛋白剪切位点的特异性亲和，在光的辐射下特异性水解天冬酰氨和脯氨酸之间的酰氨键，破坏病毒衣壳蛋白的二级结构，导致病毒死亡。本发明专利技术方法实现了对烟草花叶病毒的特异性剪切，在农业生产领域有着极大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法
本专利技术涉及一种光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，属于纳米材料和生命科学领域。
技术介绍
利用光学活性材料在电磁场作用下，将电磁场的能量转换为材料的物理和化学变化。实现纳米材料作为介质利用光来杀病毒还未见报道。特别是手性材料的电子自旋角动量和左右圆偏振光的光子角动量一致。这意味着更高的转换效率。蛋白质是生命的基础，并且由于多种结构单元和复杂的空间结构，在几乎所有生物过程（包括能量代谢，光合作用，细菌生物膜以及病毒与宿主细胞的相互作用）中都起着至关重要的作用。将蛋白质作为靶标来实现蛋白质的特异性水解、剪切、降解可以用于防控农业生产中的各种灾害，包括植物病毒病造成的各种减产。尽管，已经报道了银对多种植物病毒甚至是微生物都有很好的杀灭和防护作用。但是，利用银来防护作物和杀菌存在至少三个弊端，第一银中毒是不容忽视的；第二银的作用是非特异性的，不但会杀灭植物病毒同时对作物也有损伤；第三最关键是银是贵金属，十分昂贵。过渡金属配合物团簇已被用作有效的光捕获剂，通过形成长寿命的电荷分离的激发态（特别是被手性光激发）从而将光转换为电子的动能和势能，并由此激活一些惰性化学键来进行化学反应。特别是这些过渡金属价格便宜，来源丰富。开发过渡金属配合物团簇用于防控农业生产中的病毒病是一个理想的策略。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述不足之处，提供一种光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其能够破坏病毒衣壳蛋白的二级结构，导致病毒死亡。本专利技术的技术方案，一种光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，利用青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇和烟草花叶病毒衣壳蛋白剪切位点的特异性亲和，在光的辐射下特异性水解天冬酰氨和脯氨酸之间的酰氨键，实现对烟草花叶病毒的特异性剪切。所述的青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇和烟草花叶病毒衣壳蛋白剪切位点的特异性亲和是由于烟草花叶病毒衣壳蛋白的剪切位点附近的氨基酸可以和纳米团簇的表面配体青霉氨形成稳定的氢键，同时疏水的氨基酸和硫化铜核之间存在稳定的疏水相互作用，进而在光的辅助下发挥剪切作用特异性水解天冬酰氨和脯氨酸之间的酰氨键。具体为：筛选青霉素氨（Pen）稳定的手性硫化铜簇，用于借助圆偏振光（CPL）进行烟草花叶病毒衣壳蛋白（TMVCP）的选择性化学裂解。纳米团簇和TMVCP以多价方式相互作用，从而在CPL下通过N-Cu配位导致团簇表面出现NP(Asp-Pro)吸附，从而切断了天冬酰氨（Asp）和脯氨酸（Pro）之间的酰氨键，破坏病毒衣壳蛋白的二级结构，导致病毒死亡。青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇的制备方法，步骤如下：（1）氮气氛围保护下，在12mL超纯水的体系中，依次加入0.16mmol的一水合醋酸铜Cu(CH3COO)2·H2O，0.2mmol的氢氧化钠NaOH，0.16mmol的柠檬酸钠NaCit，0.2mmol的硼氢化钠NaBH4，0.16mmol的青霉氨Pen，95℃下回流搅拌5h；（2）步骤（1）所述反应液在氮气保护下缓慢降到室温后，继续加入不少于0.04mmol的青霉氨搅拌反应过夜；（3）纯化纳米团簇：加入6倍以上体积的异丙醇溶液，10000rpm以上离心不少于15min，获得的沉淀在65℃下0.07-0.1MPa真空烘箱干燥后，加等体积的水重悬，制得青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇，备用；（4）剪切病毒衣壳蛋白实验：将上述纯化好的纳米团簇与烟草花叶病毒衣壳蛋白（2.5mg/mL）按体积比1:1混匀于25-37℃烘箱孵育1h后转移至532nm处的圆偏振光下辐射1、2、3和6h，等到反应完成后，获取烟草花叶病毒蛋白的电泳信息，圆二色光谱，荧光光谱，液质联用色谱以及电镜图像；（5）剪切烟草花叶病毒实验：首先用10mM的pH7.4-8.0的磷酸盐缓冲液提取叶片中的烟草花叶病毒，通过超滤获得蛋白浓度2.5mg/mL的病毒颗粒。然后将纯化后的纳米团簇与烟草花叶病毒（2.5mg/mL）按体积比1:1混匀于30℃烘箱孵育1h后转移至532nm处的圆偏振光下辐射1、2、3和6h，等到反应完成后，获取烟草花叶病毒蛋白的电镜信息和WesternBlot（WB）信息；（6）电泳表征具体为：将上述混合溶液取15μL加5μLpH7.4-8.0的磷酸盐上样缓冲液，于75℃环境中反应1h，反应过程注意密封避免进水。反应完成后，取10μL每孔进行SDS-PAGE实验，浓缩胶5%，分离胶15%，电压120V，时间65min，电泳完成后，取出胶染色10min（考马斯亮蓝R250），然后用脱色液（400mL超纯水，50mL甲醇，50mL冰乙酸）于恒温摇床脱色5次，每次30min，最后获取电泳条带；（7）圆二色光谱表征具体为：取不同时间点的反应的混合溶液分别进行圆二色光谱测试，扫描波长为190-260nm，扫描速度为2s/0.2nm，扫描温度稳定在25℃。与此同时，我们获得相同浓度的蛋白质的圆二色光谱作为对照，而相同浓度的纳米团簇的圆二色光谱作为基线扣除纳米团簇的影响。（8）荧光光谱表征具体为：取不同时间点的反应的混合溶液分别进行荧光光谱测试，激发波长为280nm，扫描范围是300-450nm，与此同时，我们获得相同浓度的纯蛋白质的荧光光谱作为对照，而相同浓度的纳米团簇的荧光光谱作为基线扣除纳米团簇的影响。（9）液质联用色谱表征具体为：取完成反应的混合溶液，逐滴加入稀盐酸，并伴随不断搅拌，等混合溶液完全无色，将溶液加入内衬管中进行液质联用色谱测试。液相条件为，检测器：WATERSACQUITYPDA，检测波长：222nm，分析柱：BEHC182.1X150mm1.7um，流动相：A:1%甲酸,B:100%乙腈，流速：0.3mL/min，进样量：0.3μL，以样品40μL+100μL水稀释；质谱条件为：离子方式:ESI+，毛细管电压:3.5kV，锥孔电压:20V，离子源温度:100℃，脱溶剂气温度:400℃，碰撞能量：6/35，质量范围:20-1500m/z。（10）电镜表征具体为：取不同时间点的反应的混合溶液分别进行电镜负染制样处理，首先配制10mM的磷钨酸溶液然后通过加入1M的氢氧化钠溶液调节pH至6，将20μL的样品滴在碳膜上，5min后用滤纸吸取多余的样品，立即用磷钨酸浸泡5min，再用滤纸移除磷钨酸，再用戊二醛固定30min。电镜观察加速电压为120kV。（11）WB具体为：首先按照电泳操作进行实验，电泳完成后进行转膜，使用半干法转膜，设置电压15V，电流不超过0.2A，转膜15min，转膜完成后，先用适量的TBST缓冲液清洗PVDF膜三次，每次10min。之后用5%的脱脂奶粉4℃封闭过夜。完成封闭后，再用TBST清洗三次，每次5min，然后加入稀释好的一抗（用5%的脱脂奶粉稀释），4℃杂交过夜，然后再用TBST清洗三次，每次5min后，再加入稀释好的二抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇的制备方法，其特征在于步骤如下：/n（1）氮气氛围保护下，在12mL超纯水的体系中，依次加入0.16 mmol的一水合醋酸铜Cu(CH

【技术特征摘要】
1.一种青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）氮气氛围保护下，在12mL超纯水的体系中，依次加入0.16mmol的一水合醋酸铜Cu(CH3COO)2·H2O，0.2mmol的氢氧化钠NaOH，0.16mmol的柠檬酸钠NaCit，0.2mmol的硼氢化钠NaBH4，0.16mmol的青霉氨Pen，95℃下回流搅拌5h；
（2）步骤（1）所述反应液在氮气保护下缓慢降到室温后，继续加入不少于0.04mmol的青霉氨搅拌反应过夜；
（3）纯化纳米团簇：加入6倍以上体积的异丙醇溶液，10000rpm以上离心不少于15min，获得的沉淀在65℃下0.07-0.1MPa真空烘箱干燥后，加等体积的水重悬，制得青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇，备用。


2.一种光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：利用青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇和烟草花叶病毒衣壳蛋白剪切位点的特异性亲和，在光的辐射下特异性水解天冬酰氨和脯氨酸之间的酰氨键，实现对烟草花叶病毒的特异性剪切。


3.根据权利要求2所述光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：将纯化好的青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇与浓度为2.5mg/mL的烟草花叶病毒衣壳蛋白按体积比1:1混匀于25-37℃孵育1h，转移至532nm处的圆偏振光下辐射即可，破坏病毒衣壳蛋白的二级结构，导致病毒死亡。


4.根据权利要求3所述光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：获取反应完毕后所得烟草花叶病毒蛋白的电泳信息，圆二色光谱，荧光光谱，液质联用色谱以及电镜图像。


5.根据权利要求4所述光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：
所述电泳具体过程为：将反应混合溶液取15μL，加5μLpH7.4-8.0的磷酸盐缓冲液，于75℃环境中反应1h，反应过程注意密封避免进水；反应完成后，取10μL每孔进行SDS-PAGE实验；浓缩胶5%，分离胶15%，电压120V，时间65min，电泳完成后，取出胶染色10min，然后用脱色液于恒温摇床脱色5次，每次30min，最后获取电泳条带；所述脱色液具体为400mL超纯水，50mL甲醇和50mL冰乙酸；
所述圆二色光谱具体为：取不同时间点的反应的混合溶液分别进行圆二色光谱测试，扫描波长为190-260nm，扫描速度为2s/0.2nm，扫描温度稳定在25℃；以相同浓度的蛋白质的圆二色光谱作为对照，用相同浓度的纳米团簇的圆二色光谱作为基线扣除纳米团簇的影响；
所述荧光光谱具体为：取不同时间点的反应的混合溶液分别进行荧光光谱测试，激发波长为280nm，扫描范围是300-450nm；以相同浓度的纯蛋白质的荧光光谱作为对照，用相...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，高锐，匡华，徐丽广，孙茂忠，刘丽强，吴小玲，宋珊珊，胡拥明，郝昌龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32