基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于PCR‑RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法，属于遗传工程技术领域。包括以下步骤：(1)采集鼠类动物组织或排泄物标本；(2)提取标本总核酸；(3)扩增鼠线粒体Cyt‑b基因的完整片段，包含上下游非编码序列，其目的片段长度为1242bp；(4)同时采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行快速酶切；(5)将酶切产物1.5％琼脂糖凝胶电泳后在荧光成像系统中进行图谱分析。本发明专利技术方法具备快速、准确和廉价的优势，对人员技术、设备和试剂的成本要求较低。可以同时鉴定常见的三种鼠种，遗传物质来源广，具有很大的应用推广价值。

PCR-RFLP based rapid identification of common rodents

【技术实现步骤摘要】
基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法
本专利技术涉及家栖鼠鼠种的鉴定方法，属于遗传工程

技术介绍
鼠类动物，作为哺乳动物中繁殖最块、生存能力超强的有害动物，不仅给农业和畜牧业造成直接影响，还因其可携带、传播多种病原体，给公众健康带来巨大威胁。我国北方三大家栖鼠主要包括褐家鼠(Rattusnorvegicus)、小家鼠(Musmusculus)和黄胸鼠(Rattustanezumi)，鼠种的鉴定对于鼠的来源地追踪、种群进化分析，以及药物种类和药物投放地的选择等至关重要，从而直接影响防鼠灭鼠的效果。传统形态学的鼠种鉴定方法虽然经典但也存在诸多局限性，对鉴定人员的知识储存和鼠形态完整度均有着较高要求，而鼠的形态特征也可能随着生态学的不断变化而发生变化，给鼠种的鉴定提出了更高的要求。因此迫切需要一种准确的分子生物学鉴定方法来作为传统形态学鉴定方法的补充。随着分子生物学的不断发展和应用，其在鼠种鉴定中可发挥重要作用，如在只有鼠排泄物的条件系即可通过分子鉴定的手段快速获得鼠种的准确信息。中国专利CN105177153A公开了一种黄胸鼠PCR鉴定引物及鉴定方法，其公开了一组PCR鉴定引物及鉴定方法，但是该方法只适用于黄胸鼠鼠种的鉴定，不能同时鉴定常见的三种鼠种；其所利用的遗传物质来源为鼠尾部末端组织，遗传物质来源受限。中国专利CN109943644A公开了一种鼠种的分子鉴定方法，同时用特异引物分别扩增两组线粒体基因：但是该方法的PCR产物需要经过纯化回收，且经测序公司测序并进行核酸序列比对后，才能判断鼠种，过程较为复杂繁琐，对实验条件和设备要求较高，在应用中有其局限性。中国专利CN105385699A公开了三峡库区沿江口岸4种鼠类Cyt-b基因的特异性序列及分子鉴定方法，4种鼠类包括黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠和黑线姬鼠，然而，该专利技术同样需要进行基因测序和序列比对，过程较为复杂繁琐，对实验条件和设备要求较高。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术拟通过利用聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)联合限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)的分子生物学手段，建立我国三大家栖鼠(褐家鼠、黄胸鼠和小家鼠)鼠种快速鉴定的方法。可克服传统形态学鉴定方法的局限性，且对鉴定人员的专业分类知识要求不高，用于形态相似或外形难以判别的家栖鼠的鉴定；此外，该方法对于鼠的来源地追踪、种群进化分析，以及药物种类和药物投放地的选择均有重要作用。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案为：基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法，包括以下步骤：(1)采集鼠类动物组织或排泄物标本；(2)提取标本总核酸；(3)PCR扩增鼠线粒体Cyt-b基因的完整片段，包含上下游非编码序列，其目的片段长度为1242bp；(4)同时采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行酶切；(5)将酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在荧光成像系统中进行图谱分析；步骤(3)中，用于扩增Cyt-b基因的引物对的序列如下：序列为SEQIDNO.1的H6：5’-TCTTCATTTYTGGTTTACAAGACCA-3’；序列为SEQIDNO.2的L7：5’-ACYAATGACATGAAAAATCATCGTTG-3’。步骤(1)中，鼠类标本为内脏、血液、肌肉组织、排泄物或其他富含鼠类遗传物质的标本。步骤(3)中，用于基因扩增的PCR反应体系为：DNA模板2μL，H6和L7引物各2μL，TaqMasterMix25μL，ddH2O19μL。步骤(3)中，用于基因扩增的PCR反应条件为：94℃预变性3～5min，94℃变性1min，52～55℃退火1min，72℃延伸1min，32～35个循环，最后再72℃延伸5～10min。步骤(4)中，酶切反应体系为：步骤(3)所得PCR产物10μL，限制性内切酶BamH1和EcoRI各1μL，酶切缓冲液2μL，ddH2O16μL；37℃水浴5min。Cyt-b基因位于线粒体基因组上，线粒体基因组具有重组率低、进化速率适中等特征，同时也包含少量的遗传物质信息，是进行物种鉴定和遗传进化分析相关研究的良好靶标。本专利技术所述分子鉴定技术主要是通过对线粒体基因组上的一个DNA片段进行序列特异性分析来鉴定鼠种，为其他鼠类研究者提供了更有效的分类学手段。本专利技术的关键技术在于扩增线粒体Cyt-b基因的引物序列设计和两种限制性核酸内切酶的联合应用；引物：在NCBI基因数据库中，查找三种家栖鼠的线粒体Cyt-b基因序列，用引物设计软件Primer根据核心片段两端相似序列设计引物。本专利技术选取三种家栖鼠共有的Cyt-b基因序列来设计引物。内切酶：采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA片段，然后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列位点，然后将酶切后的产物进行电泳，由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。不同等位基因的限制性酶切位点数量或分布不同，酶切后会产生不同数量或不同长度的DNA片段条带。BamH1限制性内切酶识别位点是GGATCC或CCTAGG，在G和G之间进行切割。EcoRI限制性内切酶能专一识别GAATTC序列，在G和A之间将序列切开。扩增褐家鼠的线粒体Cyt-b基因，经BamH1和EcoRI限制性内切酶酶切后产生2个DNA片段，分别是362bp和880bp；扩增黄胸鼠线粒体Cyt-b基因酶切后，则产生长度大小分别为216bp、362bp和664bp的三条DNA片段；小家鼠的Cyt-b基因片段不具有两种限制性内切酶酶切位点，因此酶切后仍保留长度为1242bp的一条DNA片段，如附图1所示。因此，在同一实验中可以完成三种家栖鼠的同时鉴定。PCR引物与限制性内切酶相结合，即可完成序列多态性的分析，达到鼠种快速鉴定的目的，而且操作简便、成本低廉，无需再对整条基因片段进行序列测定。本专利技术的有益效果在于：本专利技术兼具快速、准确和廉价的优势，对人员技术、设备和试剂的成本要求较低，具有很大的应用推广价值。通过采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对线粒体基因PCR产物进行酶切，读取酶切图谱，即可同时鉴定常见的三种鼠种；且所需鉴定材料遗传物质来源广泛，包含鼠类组织标本即可。附图说明图1为三种家栖鼠Cyt-b基因酶切位点及产物条带大小示意图图2为对捕获的三种家栖鼠采用本专利技术方法进行鼠种验证的酶切电泳图图3为采用本专利技术方法对捕获的家栖鼠进行鼠种鉴定的酶切电泳图具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本专利技术，不应视为对本专利技术的具体限制。实施例1采用本专利技术方法对在河北省石家庄、保定、邯郸和沧州居民区本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采集鼠类动物组织或排泄物标本；(2)提取标本总核酸；(3)PCR扩增鼠线粒体Cyt-b基因的完整片段，包含上下游非编码序列，其目的片段长度为1242bp；(4)同时采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行酶切；(5)将酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在荧光成像系统中进行图谱分析；/n步骤(3)中，用于扩增Cyt-b基因的引物对的序列如下：/n序列为SEQ ID NO.1的H6：5’-TCTTCATTTYTGGTTTACAAGACCA-3’；/n序列为SEQ ID NO.2的L7：5’-ACYAATGACATGAAAAATCATCGTTG-3’。/n

【技术特征摘要】
1.基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采集鼠类动物组织或排泄物标本；(2)提取标本总核酸；(3)PCR扩增鼠线粒体Cyt-b基因的完整片段，包含上下游非编码序列，其目的片段长度为1242bp；(4)同时采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行酶切；(5)将酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在荧光成像系统中进行图谱分析；
步骤(3)中，用于扩增Cyt-b基因的引物对的序列如下：
序列为SEQIDNO.1的H6：5’-TCTTCATTTYTGGTTTACAAGACCA-3’；
序列为SEQIDNO.2的L7：5’-ACYAATGACATGAAAAATCATCGTTG-3’。


2.根据权利要求1所述的鼠种快速鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，鼠类标本为内脏、血...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘世友，严慧，魏亚梅，韩旭，蔡亚男，韩占英，张艳波，许永刚，齐顺祥，李琦，
申请(专利权)人：河北省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：河北;13