基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的方法技术

本发明专利技术公开基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的方法，其具体分析步骤如下：首先将有机磷农药与乙酰胆碱酯酶混合，紧接着向上述混合溶液中加入氯化乙酰胆碱溶液，然后再加入制备好的T‑Hg

Detection of organophosphorus pesticide activity based on the response of fluorescence molecule oli green

【技术实现步骤摘要】
基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的方法
本专利技术检测领域，具体涉及基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测。
技术介绍
有机磷农药(OPs)，是指含磷元素的有机化合物农药，是一种重要的农药类型，由于其相对高效、持久性较差，在生活中得到了广泛的应用，但由于其处理不当和残留，严重污染了农产品和环境。乙酰胆碱酯酶(AChE)是神经系统功能中主要的胆碱酯酶，它可以通过水解乙酰胆碱来特异性地调节乙酰胆碱的水平，从而调节神经冲动。抑制乙酰胆碱酯酶活性可导致乙酰胆碱在突触传递中的积累，是一种有效的疾病治疗策略。OPs能对乙酰胆碱酯酶的活性起到抑制作用，但其会对人体健康产生危害。因此，能快速、灵敏检测OPs活性的手段显得尤为重要。传统检测OPs活性的方法主要有液相色谱(LC)，气相色谱(GC)，气相色谱与质谱相结合测定法(GC/MS)，酶联免疫吸附测定(ELISA)测试等。这些方法中的大多数具有耗时长且操作复杂的缺点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的方法。本专利技术不需要复杂的标记过程，简化了检测方法，极大地降低了OPs检测成本，具有运行成本低、检测快速、简便、选择性好等优点。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的分析方法，所述分析方法包括以下步骤：第一步：首先将不同浓度的有机磷农药分别与乙酰胆碱酯酶溶液按照体积比为1:1混合，紧接着向上述混合溶液中加入氯化乙酰胆碱溶液，然后再加入T-Hg2+-T溶液，最后加OliGreen荧光分子溶液和Tris-HCl缓冲溶液并于黑暗的环境中反应一段时间，记录混合溶液的荧光光谱，将不同荧光光谱的荧光强度和与其对应的不同有机磷农药建立线性回归方法；第二步：重复第一步的步骤，除了不同浓度的有机磷农药替换为待测样品，记录待测样品经反应后的混合溶液荧光光谱，将该荧光光谱的荧光强度代入上述线性回归方程中，即可计算得到待测样品中有机磷农药的浓度；本专利技术技术方案中：第一步中不同浓度的有机磷农药的浓度为5pg/mL、50pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、5ng/mL、25ng/mL和50ng/mLDDVP溶液。本专利技术技术方案中：所述乙酰胆碱酯酶溶液的浓度为0.5mU/mL～12.5mU/mL，所述氯化乙酰胆碱溶液的浓度为0.1uM/mL-5uM/mL，乙酰胆碱酯酶与氯化乙酰胆碱溶液的体积比是1：2。本专利技术技术方案中：所述T-Hg2+-T溶液的合成步骤如下：poly(30T)与硝酸汞溶液按体积比为1：1混合后置于37℃的恒温水浴中反应20～40分钟。本专利技术技术方案中：所述p(30T)浓度为20～30nM，硝酸汞浓度为200～400nM。本专利技术技术方案中：OliGreen荧光分子溶液是将OliGreen采用水进行稀释，稀释的倍数为0.5～1x104倍。本专利技术技术方案中：所述Tris-HCl缓冲溶液为：5～10mMTris-HCl，pH6.5～8.5。本专利技术技术方案中：乙酰胆碱酯酶溶液：T-Hg2+-T溶液：OliGreen荧光分子溶液：Tris-HCl缓冲溶液的体积比为1：2：0.3～0.8：10～20。具体地，所述AChE诱导ATCh的水解及溶液的荧光变化：将5mU/mL的AChE(10μL)和1μMATCh(20μL)混合并置于37℃中温育30分钟。然后，向其中加入300nMT-Hg2+-T溶液(20μL)，继续温育30分钟。最后，将5μLOliGreen(0.005X)和145μLTris-HCl缓冲溶液加入上述混合溶液中至最终体积为200μL，并置于黑暗的环境中反应15分钟。在室温下记录该混合溶液的荧光光谱。具体地，有机磷农药检测步骤：将含有10μLAChE(5mU/mL)和10μL不同浓度的DDVP溶液混合并置于中37℃温育30分钟后，向其中加入20μLATCh溶液(1μM)，温育30分钟。然后，再加入20μLT-Hg2+-T溶液溶液(300nM)，继续温育30分钟。最后，将5μLOliGreen(0.005X)和135μLTris-HCl缓冲溶液加入上述混合物中，并在黑暗环境中反应15分钟。在室温下记录该混合溶液的荧光光谱。本专利技术的有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下的特色及优点：本专利技术原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，无需任何大型仪器，在相同条件下可以检测出更低含量的待测物。OliGreen荧光分子对poly(30T)和T-Hg2+-T这两种结构表现出不同的荧光强度。在没有有机磷农药的情况下，乙酰胆碱酯酶(AChE)将底物乙酰胆碱氯化物(ATCh)水解成胆碱(TCh)和乙酸。TCh可以夺取T-Hg2+-T溶液中的Hg2+,生成大量的TCh-Hg2+-TCh和poly(30T)，此时，溶液中的poly(30T)与OliGreen荧光分子结合有较弱的荧光信号。当有机磷农药DDVP存在时，AChE的活性受到抑制，TCh的生成受到阻碍，进而只有少量的Hg2+被TCh从T-Hg2+-T结构中夺走，因此溶液中仍存在大量的T-Hg2+-T，其与OliGreen荧光分子结合有较强的荧光信号。本专利技术不需要借助昂贵精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了有机磷农药检测成本，本专利技术具有运行成本低、检测快速简便、选择性好等优点。附图说明图1显示了基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的分析方法的流程图；图2显示了基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的分析方法的原理光谱图。图2A：T-Hg2+-T/OliGreen(a),poly(30T)/OliGreen(b),Hg2+/OliGreen(c)andOliGreen(d)；图2B：T-Hg2+-T/OliGreen(a),ATCh/T-Hg2+-T/OliGreen(b),AChE/T-Hg2+-T/OliGreen(c)andOPs/AChE/ATCh/T-Hg2+-T/OliGreen(d)andAChE/ATCh/T-Hg2+-T/OliGreen(e)；图3A显示了poly(30T)浓度的优化图；图3B显示了ATCh浓度的优化图；图3C显示了ATCh与AChE反应时间的优化图；图4A显示了定量检测DDVP的荧光强度变化图；图4B显示了荧光值与不同浓度DDVP的校准曲线。(插图：荧光强度的值与DDVP对数浓度之间的线性关系，范围为5pg/mL～25ng/mL)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术的保护范围不限于此：本实验中用到的试剂和仪器：硝酸汞(Hg(NO3)2)，购自南京晶格化学有限公司(中国南京)。盐酸,三(羟甲基)氨基甲烷，购自国药化学试剂公司(中国上海)。AChE(来自Electrophoru本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括以下步骤：/n第一步：首先将不同浓度的有机磷农药分别与乙酰胆碱酯酶溶液按照体积比为1:1混合，紧接着向上述混合溶液中加入氯化乙酰胆碱溶液，然后再加入T-Hg

【技术特征摘要】
1.基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括以下步骤：
第一步：首先将不同浓度的有机磷农药分别与乙酰胆碱酯酶溶液按照体积比为1:1混合，紧接着向上述混合溶液中加入氯化乙酰胆碱溶液，然后再加入T-Hg2+-T溶液，最后加OliGreen荧光分子溶液和Tris-HCl缓冲溶液并于黑暗的环境中反应一段时间，记录混合溶液的荧光光谱，将不同荧光光谱的荧光强度和与其对应的不同有机磷农药建立线性回归方法；
第二步：重复第一步的步骤，除了不同浓度的有机磷农药替换为待测样品，记录待测样品经反应后的混合溶液荧光光谱，将该荧光光谱的荧光强度代入上述线性回归方程中，即可计算得到待测样品中有机磷农药的浓度。


2.根据权利要求1所述基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的分析方法，其特征在于，第一步中不同浓度的有机磷农药的浓度为5pg/mL、50pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、5ng/mL、25ng/mL和50ng/mLDDVP溶液。


3.根据权利要求1所述基于荧光分子OliGreen响应构建的有机磷农药活性检测的分析方法，其特征在于，所述乙酰胆碱酯酶溶液的浓度为0.5mU/mL～12.5U/mL，所述氯化乙酰胆碱溶液的浓度为0.1uM/mL-5uM/mL，乙酰胆碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：封亚辉，戴东情，卢志刚，王晓萍，许仁富，张秀，
申请(专利权)人：南京海关工业产品检测中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32