用于质谱法的基于亚砜的试剂制造技术

本发明专利技术涉及适用于分析物分子诸如肽的质谱测定的基于亚砜的试剂，以及这样的试剂和分析物分子的加合物，以及所述试剂和加合物的应用。此外，本发明专利技术涉及用于分析物分子的质谱测定的方法。

Sulfoxide based reagents for mass spectrometry

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于质谱法的基于亚砜的试剂本专利技术涉及适用于分析物分子诸如肽的质谱测定的基于亚砜的试剂，以及这样的试剂和分析物分子的加合物，以及所述试剂和加合物的应用。此外，本专利技术涉及用于分析物分子的质谱测定的方法。在开发允许在仅几个小时中进行人类基因组学研究的新基因组测序方法之后，[1]我们现在正在见证新颖质谱方法的出现，所述方法现在使人们能够研究细胞和组织的完整蛋白质组。[2-4]。蛋白质组被定义为存在于样品中的所有蛋白质的集合，因此蛋白质组随细胞类型不同以及在不同组织中有很大差异。[5]。因此，蛋白质组学数据会提供关于细胞情况和潜在存在的疾病状态的指纹型信息。[6]要深入了解生物系统的蛋白质组，必须获取关于不同样品中的各种蛋白质的水平的定量信息。如今，这用质谱法进行。由于完整蛋白质的精确定量是困难的，所以所述方法需要对蛋白质组进行消化（胰蛋白酶消化）以得到相应的肽。为了定量这些肽，进行了诸如代谢标记、[7-8]无标记定量[9]或同量异位标记[10-11]之类的方法。由于同量异位标记能够揭示肽丰度的甚至小的差异，并且因为可以在一次测量中对比许多样品，所以它是最常用的定量方法之一。[12]。但是，仍然需要提高MS分析方法的灵敏度，特别是对于通过MS定量分析具有低丰度的肽或在只有少量材料（诸如活组织检查组织）时。目前可用的MS试剂的一个主要缺点是它们的低裂解效率，这会减少可用于定量分析的报告离子的数目并因此减少互补离子的数目。[13]另外，报告物和平衡物单元之间的裂解会降低互补离子肽的电荷状态，且这可能导致MS不可见的中性物质的形成。因此，本专利技术涉及一种用于MS中的新颖的基于亚砜的试剂，其允许极其灵敏地测定生物样品中的分析物分子诸如肽。此外，所述试剂的同位素修饰形式的应用允许获取用于对比研究的准确定量MS数据。特别地，本专利技术的试剂可以用于蛋白质组学中，从而能够精确定量复杂混合物中的肽。因而，本专利技术的第一方面是适合用作质谱分析试剂的化合物，其具有通式(I)：Z1-L1-(CR1R2)-S(O)-CR3H-CH2-C(-L2-Z2)R4(-Lx-X)其中Z1是能够携带至少一个带电荷基团的电荷单元L1是键或间隔基，Z2是能够携带至少一个带电荷基团的电荷单元，L2是键或间隔基，R1、R2、R3、R4独立地是氢或C1-C3烷基，X是能够与分析物分子反应，由此形成与所述分析物分子的共价键的反应基团，LX是键或间隔基。在一个特定方面，化合物(I)可以作为同位素异数体（isotopologue）存在，即这样的化合物：其中在本文中也被称作所述化合物的同位素中性原子，例如1H、12C、14N和/或16O原子的一种或多种主要同位素已被较少的稳定同位素（即稳定同位素诸如D、13C、15N和18O）替换。特定优选的是13C和15N。本专利技术也涉及试剂组合物或试剂盒，其包含至少一种化合物(I)，且尤其是这样的化合物(I)的多种同位素地不同的物质，它们优选地是同量异位的。本专利技术的另一个方面是化合物(I)或包含至少一种化合物(I)的组合物或试剂盒用于分析物分子、特别是包含氨基的分析物分子（诸如肽或蛋白）的质谱测定的用途。本专利技术的再另一个方面是通过化合物(I)和分析物分子的反应而形成的共价加合物。所述加合物可以是通式(II)的化合物：Z1-L1-(CR1R2)-S(O)-CR3H-CH2-C(-L2-Z2)R4-(Lx-X’)-T其中T是分析物分子，X'是由化合物(I)上的基团X与分析物分子T的反应形成的基团，Z1、L1、Z2、L2、Lx、R1、R2、R3和R4如在权利要求1-10中的任一项中所定义，其中所述加合物可以携带永久正或负电荷。式(I)的化合物与分析物分子、特别是包含肽基团的分析物分子的加合物可以用于质谱测定。通过使样品中存在的分析物分子与化合物(I)反应，可以产生所述加合物。但是，也可以将所述加合物提供为纯物质用于用作校准剂和/或标准品。本专利技术的再另一个方面是一种用于质谱测定样品中的分析物分子的方法，所述方法包括下述步骤：(a)使分析物分子与本文定义的式(I)的化合物共价地反应，由此形成所述分析物分子和化合物(I)的共价加合物，和(b)对来自步骤(a)的加合物进行质谱分析。本专利技术进一步涉及通过MS、且特别是通过定量MS对分析物分子的测定。所述分析物分子可以是能够与本专利技术的化合物(I)上的反应基团X形成共价键的任何物质。例如，所述分析物可以是生物分子，其选自肽、蛋白、碳水化合物、氨基酸、脂肪酸、脂质、核苷、核苷酸、核酸和其它生物分子，包括小分子代谢物和辅因子以及药物、农业试剂、毒素或其代谢物。一般而言，分析物分子可以存在于生物、临床或环境样品中，诸如体液，例如血液、血清、血浆、尿、唾液等，组织或细胞提取物，等。在本专利技术的某些实施方案中，可以不经进一步纯化地使用细胞或组织的完全裂解物。但是，当然，所述分析物分子可以存在于样品中，所述样品是纯化的或部分纯化的样品，例如纯化的或部分纯化的蛋白混合物或提取物。根据一个特别优选的实施方案，所述分析物分子是肽或蛋白质，特别是被包含在复杂样品中的肽或蛋白质。例如，可以在一次MS测量中针对感兴趣的肽或蛋白质分析细胞或组织的完整蛋白质组。优选地，在分离之后，将蛋白质组（即样品中所有蛋白质的集合）消化以提供较小的肽，然后用本文所述的试剂标记。在特定优选的实施方案中，分析物分子是能够与化合物(I)的反应基团X形成共价键的具有氨基的蛋白质、肽或物质。这样的氨基可以是肽链的N-端氨基和/或侧链的氨基，例如赖氨酸的氨基。根据另一个实施方案，所述分析物分子包含至少一个巯基，其能够与化合物(I)的反应基团X形成共价键，诸如含有Cys的肽。当然，待分析的肽或蛋白质还可以包含翻译后修饰诸如糖基化、酰化等。通过翻译后修饰向蛋白质添加的此类残基也可以被本专利技术的试剂靶向。此外，所述分析物分子也可以是碳水化合物或具有碳水化合物基团的物质，例如糖蛋白或核苷。例如，所述分析物分子可以是单糖诸如核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、核酮糖、葡萄糖、甘露糖等，或寡糖，例如二糖（诸如蔗糖、麦芽糖或乳糖）或三糖或四糖，以及多糖，或包含这样的单糖、寡糖或多糖基团的物质。所述分析物分子可以包含羰基，例如醛或酮基、或被掩蔽的醛或酮基，例如能够与化合物(I)的反应基团X形成共价键的半缩醛基，特别是环状半缩醛基。所述分析物分子也可以包含缩醛基，其可以在与化合物(I)反应之前被转化为醛、酮或半缩醛基。本专利技术的化合物(I)包含能够与分析物分子反应，由此形成与所述分析物分子的共价键的反应基团X。在一个优选的实施方案中，基团X选自(i)羰基反应基团，其能够与任何类型的具有羰基的分子（例如碳水化合物分子）反应，(ii)巯基反应基团，其能够与任何类型的具有巯基的分子（例如含有Cys的肽）反应，或(iii)胺反应基团本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于质谱法中的试剂，所述试剂是通式(I)的化合物：/nZ

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170908 EP 17190147.31.一种用于质谱法中的试剂，所述试剂是通式(I)的化合物：
Z1-L1-(CR1R2)-S(O)-CR3H-CH2-C(-L2-Z2)R4(-Lx-X)
其中
Z1是能够携带至少一个带电荷基团的电荷单元，
L1是键或间隔基，
Z2是能够携带至少一个带电荷基团的电荷单元，
L2是键或间隔基，
R1、R2、R3、R4独立地是氢或C1-C3烷基，
X是能够与分析物分子反应，由此形成与所述分析物分子的共价键的反应基团，
LX是键或间隔基。


2.权利要求1的试剂，其中所述电荷单元Z1和Z2各自包含至少一个带正电荷的基团，诸如伯、仲、叔或季铵基或鏻基，特别是具有10或更高的pKa，更特别是具有12或更高的pKa。


3.权利要求1的试剂，其中所述电荷单元Z1和Z2各自包含至少一个带负电荷的基团，诸如磷酸根、硫酸根、磺酸根或羧酸根基，特别是具有10或更高的pKb，更特别是具有12或更高的pKb。


4.权利要求1-3中的任一项的试剂，其中所述电荷单元Z1和Z2具有相同电荷。


5.权利要求1-4中的任一项的试剂，其中所述电荷单元Z1和Z2永久地带电荷。


6.权利要求1-5中的任一项的试剂，其中所述反应基团X是
(i)羰基反应基团，其能够与分析物分子上的羰基例如醛或酮基或被掩蔽的羰基例如半缩醛基反应，其中所述羰基反应基团X可以选自通过相邻的O和/或N原子诸如NH2-N/O造成的α效应而增强的超亲核N原子或二巯基基团，或者
(ii)巯基反应基团，诸如烯烃或炔烃，其能够与分析物分子上的巯基例如Cys-基团反应，或者
(iii)胺反应基团，其能够与分析物分子的胺例如氨基反应。


7.权利要求1-6中的任一项的试剂，其中X可以具体地选自
(i)肼基团，例如H2N-NH-、或H2N-NR1-基团，
其中R1是芳基或C1-4烷基，特别是C1或C2烷基，其任选地被取代，
(ii)腙基团，例如H2N-NH-C(O)-、或H2N-NR2-C(O)-基团，
其中R2是芳基或C1-4烷基，特别是C1或C2烷基，其任选地被取代，
(iii)羟基氨基，例如H2N-O-基团，
(iv)二巯基，特别是1,2-二巯基或1,3-二巯基，
(v)亲电子的烯烃基，例如R1R2C=CR3-C(O)-NH-
其中R1、R2和R3独立地是H、卤素或C1-4烷基，优选H，
(vi)活性酯基诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或磺基-NHS、羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)基团或亚氨酸酯-CH2-C(=NH2+)-O-CH3。


8.权利要求1-7中的任一项的试剂，所述试剂具有通式(Ia)：
Z1-L1-(CR1R2)-S(O)-CR3H-CH2-C(-L2-Z2)R4(-Lx-X1)
其中
Z1包含至少一个带正电荷的基团诸如伯、仲、叔或季铵基团，
L1是间隔基，特别是-C(O)-NH-(CH2)n-，其中n是1-10的整数，其中n优...

【专利技术属性】
技术研发人员：T卡雷尔，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH