一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法技术

本发明专利技术涉及生物科技技术领域，具体的说是一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法，包括心肌肌钙蛋白I溶液配制、微流控肌钙蛋白检测芯片及其使用方法、微流控芯片是以微管道网络为结构特征，各工作单元既能独立完成单一反应或单元操作，也能与其他单元合作完成较复杂的工作，使整个芯片称为一个动态的反应体系。其主要特点是高通量、微型化和自动化，是在传统生物技术和疾病诊断等方面的创新和飞跃；免疫微球化学发光与微流控芯片的结合使得全自动化仪器更加小型化和简单化，减少了后期的管道维护和机械臂维护；而且这两者的结合又将原本POCT应用的固相反应转换成了液相的均相反应，更兼具了传统管式化学发光的高反应效率，高灵敏度及检测区间。

A quantitative detection method of cardiac troponin I

【技术实现步骤摘要】
一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法
本专利技术涉及生物科技
，具体的说是一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法。
技术介绍
心脏横纹肌收缩中起主要调节作用的蛋白质。有三个亚基：与原肌球蛋白结合的肌钙蛋白T、调节肌动蛋白ATP酶活性的肌钙蛋白I和钙结合的肌钙蛋白C。cTnI和cTnT的临床应用价值相同，不需要同时检测。心肌肌钙蛋白I是具有抑制性的亚基,分子量为24000Da，等电点在9以上。其存在三种形式，分别是心肌肌钙蛋白I、快型骨骼肌肌钙蛋白I和慢型骨骼肌肌钙蛋白I。其中前者特异的存在于心肌中，分子量为24000Da，后两者存在于骨骼肌中，分子量为19800Da。三者由不同亚基进行编码，其中心肌肌钙蛋白I的氨基酸序列仅有50％左右与两种骨骼肌肌钙蛋白I同源，并且与骨骼肌肌钙蛋白I相比，心肌肌钙蛋白I有额外的31个氨基酸残基。且骨骼肌、肝、肾等细胞破坏均不影响其结果的判断，因此肌钙蛋白I具有良好的特异性。当心肌细胞发生损伤时，肌原纤维发生裂解使得肌钙蛋白I通过外周释放入血液当中最后通过肾脏代谢。由于肌钙蛋白I具有高度的组织特异性，在血液中6小时达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)心肌肌钙蛋白I溶液配制：/n1A、心肌肌钙蛋白I系列校准品的制备：用小牛血清将心肌肌钙蛋白I抗原梯度稀释成一组校准品，浓度范围为0～100ng/mL；/n1B、心肌肌钙蛋白I抗体包被的磁珠溶液的制备：/n方案A：/na1、将1.5μL羧基磁微粒用活化/偶联缓冲液充分清洗3次，在最后一轮洗涤后，将微球重悬于活化/偶联缓冲液中，并确保磁微粒保持分散态；/na2、在室温条件下用去离子水配制200mM EDC和200mM Sulfo-NHS活化试剂；/na3、向每mg洗涤后的磁微粒中快速加入24μL 200mM EDC和240μ...

【技术特征摘要】
1.一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)心肌肌钙蛋白I溶液配制：
1A、心肌肌钙蛋白I系列校准品的制备：用小牛血清将心肌肌钙蛋白I抗原梯度稀释成一组校准品，浓度范围为0～100ng/mL；
1B、心肌肌钙蛋白I抗体包被的磁珠溶液的制备：
方案A：
a1、将1.5μL羧基磁微粒用活化/偶联缓冲液充分清洗3次，在最后一轮洗涤后，将微球重悬于活化/偶联缓冲液中，并确保磁微粒保持分散态；
a2、在室温条件下用去离子水配制200mMEDC和200mMSulfo-NHS活化试剂；
a3、向每mg洗涤后的磁微粒中快速加入24μL200mMEDC和240μL200mMSulfo-NHS；
a4、室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30分钟后磁吸后去除上清，然后加入活化/偶联缓冲液洗涤微球并充分洗涤3次；
a5、重悬磁微粒后按每mg磁珠加入20～80μg，充分混匀后在室温下用转盘式混合器混合悬液2.5小时，磁吸后去除上清，加入1mL含0.5％牛血清白蛋白的Tris溶液，室温下用转盘式混合器反应0.5小时；
a6、磁吸去上清，用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤3次，并以此最终保存于2～8℃；
方案B：
b1、用PBS缓冲液制备Biotin溶液，将每mg抗体与25μLBiotin溶液室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；
b2、用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液将1.5μm链霉亲和素磁微粒洗涤三次，在每mg磁微粒中加入20～80μg已处理的抗体，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育0.5～2小时；
b3、最后用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤三次后加入保存液2～8℃保存。
1C、碱性磷酸酶标记的心肌肌钙蛋白I抗体溶液的制备：
c1、用PBS缓冲液配制SPDP溶液，在每mg抗体中加入20～50μLSPDP溶液，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；
c2、用PBS缓冲液配制2-IT溶液，在每mg碱性磷酸酶中加入20～50μL2-IT溶液，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；
c3、经处理后的抗体和碱性磷酸酶等比例混合，室温涡旋震荡后继续用转盘式混合器孵育2小时，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；
c4、最后用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液进行稀释并于2～8℃保存；
1D、化学发光底物液的制备：AMPPD加入到高PH值的Tris盐酸缓冲液中，加入无机盐和表面活性剂；
1E、清洗液的制备：在Tris盐酸缓冲体系中加入20％氯化钠，2％吐温以及0.2％曲拉通；
(2)微流控肌钙蛋白检测芯片及其使用方法：
2A、标准曲线的制作：取10μL心肌肌钙蛋白I梯度校准品，浓度为0，0.05，0.2，1，5，25，100ng/mL，加入到微流控芯片校准品槽中，取50μL试剂加入到对应的试剂槽中，根据配套仪器内部设置的反应过程进行反应，读取光子信息后将由仪器处理并直接获得标准曲线；
2B、微流控肌钙蛋白检测芯片操作流程：
b1、注入50微升的全血，全血为男性样本，血溶比为53％，即血浆占比47％、血球占比53％，至全血储存槽(1)，注入15微升带有捕捉抗体的免疫微球至第一试剂储存槽(7)，注入15微升的酶标至第二试剂储存槽(10)；
b2、以5000RPM，加速度为10000RPM/s操控盘式芯片进行旋转60秒钟，已分离的血浆会被保留于血浆/血清储存槽(2)、血球则被保留于血球储存槽(6)，免疫微球带有捕捉抗体、酶标带有...

【专利技术属性】
技术研发人员：林佳慧，杨意枫，倪燕婕，连海燕，钱靖，陆斐斐，
申请(专利权)人：苏州国科均豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32