一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法技术

本发明专利技术涉及一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法，预处理方法为将血液样品自然晾干制成干血斑，将干血斑放入96孔板过滤机中加入萃取液进行离心过滤，96孔板的内部放置聚四氟乙烯薄膜。聚四氟乙烯薄膜的孔径为0.22‑0.45μm。96孔板过滤机的转速为小于等于3000r/min。本发明专利技术的预处理方法不仅具有对干血斑的萃取液极好的通透性，而且过滤干净，基本没有杂质，峰型稳定，检测结果准确性好。

A pretreatment method for amino acid and carnitine screening in neonatal blood tablets

【技术实现步骤摘要】
一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法
本专利技术属于氨基酸肉碱检测领域，具体涉及一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。遗传性代谢病(inbornerrorofmetabolism，IEM)是一类涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、类固醇等多种物质代谢的疾病。其种类繁多，是儿科临床的疑难杂症。虽然其单一病种患病率较低，但总体发病率较高，对人口素质、家庭乃至社会的发展构成了极大的威胁。新生儿筛查是指在新生儿期通过对某些危害严重的遗传代谢缺陷、先天性疾病进行群体筛查，早期诊治，从而避免或减轻疾病的危害。LC-MS/MS技术的发展使得类似苯丙酮尿症这类遗传代谢疾病在发病前进行干预成为可能。即在新生儿出生后体内某些代谢产物出现异常，而尚未出现临床症状或者症状不明显时就早期明确诊断，并进行及时而有效的对症治疗，以避免患儿的重要脏器出现不可逆性损害，进而保障儿童正常的体格发育和智能发育。串联质谱用于遗传代谢病的筛查诊断，主要通过数十种小分子的分析，筛查出包括氨基酸病、有机酸代谢紊乱和脂肪酸氧化缺陷在内的多种遗传代谢病，大大提高了筛查效率，实现了“一种实验检测一种疾病”到“一种实验检测多种疾病”的转变。基于串联质谱平台研发的新生儿遗传代谢病筛查试剂盒主要是将新生儿干血滤纸片中的氨基酸、有机酸、酰基肉碱萃取出来进行质谱分析。新生儿遗传代谢病筛查试剂盒(即非衍生化法多种氨基酸、肉碱测定试剂盒)的样品前处理简单易操作，通过打孔器在干血滤纸片，然后加入萃取液，萃取后进行分析，萃取过程发生的装置即为过滤装置，过滤装置一般以针头式过滤器为主。针头式过滤装置不能批量处理样本，处理时间长，且所需样本量大，处理过程样本损失量大，所以不适合新生儿筛查项目。在样本正常提取的前提下，随着进样数目增多，仪器的清洗频率增大，若不及时清洗，造成仪器故障的频率越大，影响使用及检测。大批量样本进样时，液相色谱仪的高压阀转子、进样针及管路容易堵塞，造成压力过高，无法进样，同时杂质也在质谱的喷针及锥孔处积累，造成采集信号越来越低，影响样本检测准确性。在实验中发现，连续进样1000针后液相色谱仪压力超过承受上限，个别物质质谱采集信号低于定量限。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法。为了解决以上技术问题，本专利技术的技术方案为：一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法，预处理方法为将血液样品自然晾干制成干血斑，将干血斑利用试剂盒进行提取，然后取上清液放入96孔板过滤板内利用96孔板离心机进行过滤，96孔板的内部放置聚四氟乙烯薄膜。本专利技术的预处理方法对干血斑的检测稳定性强，可重复性好，相比于现有的干血斑whatman903号纸预处理方法具有更好的检测效果，进样10000针不会发生堵塞现象。相比于其它预处理方法，具有更好的通透性和检测稳定性。在一些实施例中，96孔板过滤机的转速为小于等于3000r/min。聚四氟乙烯薄膜配合96孔板离心机的转速能够保证液体通过聚四氟乙烯薄膜，满足液体较好的通透性。在一些实施例中，96孔板离心机的离心力是1100-1200g。离心力保证聚四氟乙烯薄膜的通透性，同时与聚四氟乙烯薄膜配合，避免聚四氟乙烯薄膜出现破裂的情况，使液体中混入杂质。在一些实施例中，聚四氟乙烯薄膜的孔径为0.22-0.45μm。膜的孔径影响膜的过滤效果，在承受压力一定的条件下，与一定孔径的膜进行配合能够过滤的更干净。在一些实施例中，96孔过滤板中的每个容积为400-450μL。上述利用试剂盒进行提取的具体步骤为：利用打孔器将干血斑移入U-型底96孔微孔板内，每孔加入内标工作溶液，覆上封膜，振荡孵育，揭下封膜，将每孔内的溶液转移至对应的V-型底96孔耐热微孔板内，覆上封膜。在一些实施例中，内标工作溶液为含有氨基酸内标和肉碱内标的萃取液，稀释比例为氨基酸内标浓缩液：肉碱内标浓缩液：萃取液＝1:1:196-200。在一些实施例中，振荡孵育的温度为28-32℃，振荡的频率为600-800rpm，振荡孵育的时间为40-45min。在一些实施例中，离心的过程为：96孔板过滤板与V-型底96孔耐热微孔板叠放设置，96孔板过滤板过滤后的过滤液进入V-型底96孔耐热微孔板。然后将V-型底96孔耐热微孔板放入自动进样器，进行检测。本专利技术的有益效果：通过本申请的预处理步骤后验证20000例均正常进样，液相体系压力正常，质谱采集信号不降低。相比之前进样1000针仪器频出故障的情况来讲，加过滤板后的效果具有明显优势。1.96孔过滤板可实现批量操作，节省时间，离心1min后整板样品即可上机检测；2.96孔过滤板成本低，适合配套到新筛试剂盒中；3.大大降低仪器堵塞故障率，同时可节约更换仪器配件的花费；4.不影响实验回收率；5.适用范围广，应用前景广，相同类产品可平移使用。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为10000针样本信号统计图；图2为10000针样本异常峰型统计图；图3为10000针总离子流信号统计图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面结合实施例对本专利技术进一步说明实施例1临床正常人样本1mL，制成若干个干血斑，自然晾干呈深褐色。具体过程为：1)用3mm打孔器在质控干血斑和待测样本干血斑上打孔并分别移入U-型底96孔微孔板内。2)每孔内加入配制好的内标工作溶液90μL，覆上粘性封膜。3)30℃下700rpm振频振荡孵育45min。4)揭去粘性封膜，每孔转移75μL溶液至对应序号位置的V-型底96孔耐热微孔板内，覆上铝箔封膜。5)将V-型底96孔耐热微孔板内的上清液放入96孔板过滤板内利用96孔板离心机进行过滤，96孔板过滤板的内部放置聚四氟乙烯薄膜，96孔板过滤板与V-型底96孔耐热微孔板叠放设置；6)将离心后的V-型底96孔耐热微孔板放入自动进样器中，上机检测。内标工作溶液为含有氨基酸内标和肉碱内标的萃取液，稀释比例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法，其特征在于：预处理方法为将血液样品自然晾干制成干血斑，将干血斑利用试剂盒进行提取，然后取上清液放入96孔板过滤板内利用96孔板离心机进行过滤，96孔板的内部放置聚四氟乙烯薄膜。/n

【技术特征摘要】
1.一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法，其特征在于：预处理方法为将血液样品自然晾干制成干血斑，将干血斑利用试剂盒进行提取，然后取上清液放入96孔板过滤板内利用96孔板离心机进行过滤，96孔板的内部放置聚四氟乙烯薄膜。


2.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法，其特征在于：96孔板过滤机的转速为小于等于3000r/min。


3.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法，其特征在于：96孔板过滤机的离心力是1100-1200g。


4.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法，其特征在于：聚四氟乙烯薄膜的孔径为0.22-0.45μm。


5.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法，其特征在于：96孔板中的每个容积为400-450μL。


6.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯振，景叶松，弭兆元，
申请(专利权)人：山东英盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37