用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基及其发酵培养方法技术

本发明专利技术提供了一种用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基及其发酵培养方法，其中发酵培养基的组分包括糊精、玉米淀粉酶解液、丁二酸、酵母粉、L‑天冬氨酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、氯化铁、硫酸锰、吡啶醇、氯化钴、三聚磷酸钠、H

Fermentation medium and method for high iron production of Pseudomonas fluorescens

【技术实现步骤摘要】
用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基及其发酵培养方法
本专利技术涉及微生物技术以及生物防治领域，具体的说是一种用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基及其发酵培养方法。
技术介绍
植物病害是植物在生物或非生物因子影响下，发生一系列形态、生理和生化上的病理变化，阻碍了植物正常生长、发育进程，从而影响经济效益的现象。目前植物病害的防治主要依赖于化学农药，长期使用容易造成严重的环境污染及生态环境的破坏等一系列问题。生物防治指利用一些有益微生物，对土壤中特定的病原菌产生有害物质，通过产生抗生性次级代谢产物、竞争空间、食物等方式抑制病原菌对植物的侵害。作为植物病害综合防治中的一项重要防治手段，生物防治因其对环境友好的特点得到世界广泛认可。目前，成功应用于植物病害生物防治的微生物涉及真菌、细菌、放线菌等很多生物种群，各种生防微生物的应用，是保护生态环境，实现农业可持续发展的有力保证。荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）属薄壁菌门假单胞菌科假单胞菌属，在自然界分布广泛，其中相当一部分是植物是植物根际促生菌（PlantGrowthPromotingRhizobacteria，PGPR），能够利用根系分泌物中营养物质迅速定殖于植物根围，具有促进植物生长和防治病害的双重作用，因而可用于防治植物病害。研究表明，荧光假单胞菌对植物病害的防治机制包括以下几点：1）抗生素的抑制作用。荧光假单胞菌能产生多种抗生素如吡咯菌素、绿脓菌素、卵菌素A、1-羧基吩嗪、2,4-二乙酰藤黄酚、藤黄绿脓菌素等，这些抗生素都有一定的特异性和专一性，能够有针对性地抑制不同的植物病害。2）铁载体介导下的抑制作用。3）根部定殖。荧光假单胞菌能在植物根系表面形成均匀的保护层，不能拮抗病原菌的菌株则不产生相应的保护层，因此荧光假单胞菌降低了根系生长期间的感染风险，保护了病原菌的侵染位点。4）产生许多其它具有抗性的次生代谢物，如氰化氢（HCN）、乙二酸、环形脂肽等。5）诱导系统抗性作用。6）溶菌作用。荧光假单胞菌能产生木聚糖酶、溶菌酶和胞外壳聚糖酶及能够分解真菌细胞壁的几丁质酶等。铁元素不仅参与维持微生物细胞内多相体系的渗透平衡，还是微生物代谢过程中多种酶反应的必要成分，铁元素的缺乏能够限制微生物的生长。由于氧化作用，土壤中的铁大部分以Fe3+的形式存在，由于Fe3+的溶解度很低，所以在根系微环境下各类生物可直接吸收的可溶铁是很少的。铁载体，又名嗜铁素，是一类由微生物在低铁条件下合成的小相对分子质量的、能特异地螯合Fe3+的一种螯合因子。荧光性假单胞菌能分泌高亲和力的铁载体，在低铁环境下，铁载体可以螯合环境中微量的铁元素，通过特异的转运系统将铁转移到体内，不仅可以满足自身的生长需要，还可以使环境中的铁浓度降低，抑制病原微生物的生长繁殖，进而达到控制植物病害的目的。同时，铁载体铁离子络合物也可作为一种铁源被植物利用，促进植物的生长，这些特点使荧光假单胞菌在植物的生物防护中能够发挥重要作用。目前发现的荧光假单胞菌铁载体有假单胞菌素、绿脓菌螯铁蛋白、脓青素等。虽然荧光假单胞菌在生物防治领域拥有巨大的发展前景，但在实际应用上仍有许多问题，例如缺乏荧光假单胞菌高效生防菌株，以及生防菌株抑菌代谢产物的发酵效价较低，影响了产业化发展的进程等。培养基的营养成分如碳源、氮源、无机盐和生长因子等是微生物生长与繁殖所必需的。除了需要适宜的营养条件外，pH值、溶氧、温度、种龄与接种量等培养条件也至关重要。因此发酵培养基成分和发酵条件对荧光假单胞菌生长繁殖和抑菌代谢产物生物合成均有重要影响。为了进一步提高荧光假单胞菌生防菌株的抑菌活性，专利技术人在现有研究基础上，对荧光假单胞菌产铁载体的发酵培养基组分及发酵条件进行了优化实验，为其工业化生产和开发利用提供依据。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，以及利用该培养基发酵培养荧光假单胞菌的方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，其特征在于，配方为：糊精13.0-18.0g/L，玉米淀粉酶解液6.0-10.0g/L，丁二酸2.7-3.5g/L，酵母粉2.5-3.5g/L，L-天冬氨酸1.4-2.0g/L，磷酸氢二钾3.0-4.0g/L，磷酸二氢钾1.2-2.0g/L，硫酸镁0.9-1.5g/L，氯化钠0.5-1.0g/L，氯化铁7-13μmol/L，吡啶醇0.8-1.2mg/L，氯化钴0.02-0.04mg/L，硫酸锰0.01-0.02mg/L，三聚磷酸钠36-44μmol/L，H2O210-14mmol/L，司盘-600.5-1.5g/L。所述培养基的初始pH值为6.6-7.0。所述配方中玉米淀粉酶解液的制备方法为：将玉米淀粉加水制成浓度为25%的浆液，先加入耐高温α-淀粉酶，在100℃、pH6.5的条件下反应10min后灭活酶；然后加入糖化酶，在55℃、pH4.5的条件下糖化处理24h，离心取上清即为玉米淀粉酶解液。包括如下步骤：1）将荧光假单胞菌菌株在斜面培养基上活化24h，挑取单菌落接种于10mL种子培养基中，置于摇床上振荡培养24h制得一级种子液；2）取5mL一级种子液接种于100mL种子培养基中，置于摇床上振荡培养10-15h制得二级种子液；3）将二级种子液接种到装有权利要求1所述发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养，摇瓶装液量为35%-45%，发酵过程中温度控制在28-30℃，转速控制在180-220rpm，发酵时间为36-44h。所述步骤1）中斜面培养基的配方为：蛋白胨16g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾0.75g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂15g/L，pH值为7.0。所述步骤1）和2）中种子培养基的配方为：蛋白胨16g/L，酵母粉4g/L，甘油15ml/L，磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁2.0g/L，pH值为7.0。所述步骤1）和2）中温度控制在26-30℃，转速控制在150-200rpm。所述步骤3）中二级种子液的接种量为：1.5%-2.5%。本技术方案的优点在于：本专利技术对荧光假单胞菌产铁载体的发酵培养基配方及其发酵条件进行了研究改进，培养基中采用糊精、玉米淀粉酶解液和丁二酸作为复合碳源，酵母粉和L-天冬氨酸作为复合氮源，硫酸锰、氯化钴、吡啶醇、氯化铁、三聚磷酸钠、H2O2和司盘-60这些成分的添加有利于荧光假单胞菌的生长繁殖与铁载体的合成分泌。与采用常规产铁载体培养基相比，采用本专利技术培养基进行培养，荧光假单胞菌的生物量可提高2~3倍，铁载体产量可提高3~5倍。采用本专利技术方法制备的荧光假单胞菌发酵液对灰葡萄孢（番茄灰霉病菌）和尖孢镰刀菌苦瓜专化型（苦瓜枯萎病菌）有明显的抑制作用，抑菌率分别达到79.33%和60.68%。本专利技术为荧光假单胞菌在生物防治上进一步应用奠定了基础。附图说明图1为吡啶醇对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，其特征在于，配方为：糊精13.0-18.0g/L，玉米淀粉酶解液6.0-10.0g/L，丁二酸2.7-3.5g/L，酵母粉2.5-3.5g/L，L-天冬氨酸1.4-2.0g/L，磷酸氢二钾3.0-4.0g/L，磷酸二氢钾1.2-2.0g/L，硫酸镁0.9-1.5g/L，氯化钠0.5-1.0g/L，氯化铁7-13μmol/L，吡啶醇0.8-1.2mg/L，氯化钴0.02-0.04mg/L，硫酸锰0.01-0.02mg/L，三聚磷酸钠36-44μmol/L，H

【技术特征摘要】
1.用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，其特征在于，配方为：糊精13.0-18.0g/L，玉米淀粉酶解液6.0-10.0g/L，丁二酸2.7-3.5g/L，酵母粉2.5-3.5g/L，L-天冬氨酸1.4-2.0g/L，磷酸氢二钾3.0-4.0g/L，磷酸二氢钾1.2-2.0g/L，硫酸镁0.9-1.5g/L，氯化钠0.5-1.0g/L，氯化铁7-13μmol/L，吡啶醇0.8-1.2mg/L，氯化钴0.02-0.04mg/L，硫酸锰0.01-0.02mg/L，三聚磷酸钠36-44μmol/L，H2O210-14mmol/L，司盘-600.5-1.5g/L。


2.根据权利要求1所述的用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，其特征在于，所述培养基的初始pH值为6.6-7.0。


3.根据权利要求1所述的用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，其特征在于，所述配方中玉米淀粉酶解液的制备方法为：将玉米淀粉加水制成浓度为25%的浆液，先加入耐高温α-淀粉酶，在100℃、pH6.5的条件下反应10min后灭活酶；然后加入糖化酶，在55℃、pH4.5的条件下糖化处理24h，离心取上清即为玉米淀粉酶解液。


4.一种荧光假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将荧光假单胞菌菌株在斜面培养基上活化24h，挑取单菌落接种...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建军，
申请(专利权)人：陈建军，
类型：发明
国别省市：甘肃;62