一种基于微流控技术制备的高均一性多巴胺修饰的明胶微球、制备方法及其在作为细胞微载体方面应用，属于材料科学技术领域。本发明专利技术通过光刻技术与等离子刻蚀方法构筑Y字形微通道，通过微流体液滴技术制备高均一性明胶微球，将明胶微球置于多巴胺Tris‑HCl缓冲溶液中，利用多巴胺碱性条件下自我聚合为聚多巴胺性质，使明胶表面形成高黏附聚多巴胺涂层。该方法操作简单，不涉及复杂昂贵的制备技术。相对于传统裸漏的明胶表面，经多巴胺处理后的明胶微球能很好地促进神经细胞的黏附与分化，这对于提高细胞移植后存活率，后期组织治疗效果具有深远意义。
Dopamine modified gelatin microspheres, preparation methods and their application as cell microcarriers
【技术实现步骤摘要】
多巴胺修饰的明胶微球、制备方法及其在作为细胞微载体方面的应用
本专利技术属于材料科学
，具体涉及一种基于微流控技术制备的高均一性多巴胺修饰的明胶微球、制备方法及其在作为细胞微载体方面应用。该微载体基于多巴胺超黏附性，实现了细胞高运载效率，进一步促进了神经前体细胞的分化与功能表达。
技术介绍
帕金森综合症是一种常见的神经系统退行性疾病，主要由腹侧中脑多巴胺神经元坏死引起。相关研究表明，将多巴胺神经元注入到患者中脑，能起到明显的治疗效果，显著提高患者的运动能力。但由于细胞在移植过程中，细胞处于游离状态及注射过程中针头剪切力的存在，会极大降低细胞在组织中存活率。目前经临床审批通过的神经元绝大多数是由胚胎干细胞悬浮分化诱导所得，其自身增殖分化过程均为悬浮状态，不贴附于材料，这进一步增加了移植难度。因此，开发一种可注射、促进神经元黏附、提高其体内存活率的微凝胶是研究人员需要解决的首要问题。微流控技术是将数十到数百个微米级孔道集成，向其注入少量液体，对其进行系统的操控和控制，微流体液滴是基于微流控技术，构筑“Y、T、十字”等微结构孔道，向孔道内通入不相溶的两相，通过局部乳化方式高效生产微米级凝胶微球，由于其可注射性，广泛应用于细胞运载等生物领域。目前微流体液滴所生产的微凝胶表面性质单一，绝大多数为裸漏的凝胶表面，一些自我悬浮增殖克隆的细胞，如胚胎干细胞、神经干细胞等，裸漏的微凝胶不能为其提供很好的黏附表面位点。在贻贝黏附蛋白的启发下，从2007年起，聚多巴胺作为一种简单高效改进表面功能的镀膜广泛被人们使用。多巴胺是含有邻苯二酚还有氨基的化合物，在碱性条件下邻苯二酚会转化为醌自我聚合形成聚多巴胺，赋予材料极强的细胞黏附能力。近年来，聚多巴胺涂层由于其极强的黏附性能被广泛应用在生物领域，但在高均一性明胶微球表面镀多巴胺提高细胞运载能力的报道极为少见。基于上述问题，本专利技术基于微流体液滴技术，利用多巴胺高黏附性，制备了可注射、促进细胞贴附、分化又能提高其移植后存活率的可以用作细胞微载体的多巴胺明胶微球。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于微流体液滴技术室温条件下制备的高效负载神经细胞的高均一性多巴胺修饰的明胶微球、制备方法及其在作为细胞微载体方面应用。随着多巴胺修饰时间的增加，明胶微载体对神经细胞的黏附能力有显著的提升，并对神经细胞分化也有明显的促进作用。本专利技术涉及光刻技术与等离子刻蚀方法构筑Y字形、水油两相孔道夹角为60°的微通道，在水油两相孔道中分别通入不互溶的两相分别是甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体和混有SPAN80的矿物油，经紫外光固化，清洗后加入到多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中进行多巴胺镀膜修饰。整个过程操作简单，不涉及复杂昂贵的制备技术。本专利技术主要通过微流体液滴技术构筑高均一性明胶微球，经多巴胺修饰后很好地促进神经细胞的黏附与分化。本专利技术所述的一种基于微流体液滴技术制备的高均一性多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，如图1所示，其步骤如下：(1)4-(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体的制备：将8～15g明胶与1～2g的4-(二甲氨基)吡啶溶于40～60℃、80～150mL的二甲基亚砜中，待充分溶解后，在N2保护的环境下向其中加入3～5mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应60～80小时后取出倒入渗析带，在30～50℃下去离子水渗析2～4天，将得到的渗析液冻干后放入-90～-70℃环境保存，得到4-(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体；(2)微流体液滴芯片制备：微流体液滴芯片经基片处理、旋涂光刻胶、紫外掩模版曝光、等离子刻蚀、聚二甲基硅氧烷(PDMS)翻模、孔道键合等步骤制备得到，具体参见DavidA.Weitzetal.Small,1702955,14,(2018)]；孔道结构如图1(a)所示，由水相入口及水相输运孔道(宽度为100～200μm，长度为6～8mm的直线型孔道)、油相入口及两条对称分布在水相输运孔道两侧、距离水相输运孔道最大平行距离为6～8mm的油相输运孔道(宽度为100～200μm，长度为2～3cm的折线型孔道)、液滴出口及液滴输运孔道(宽度为300～500μm，长度为3～4cm的正弦曲线型孔道，此结构有利于液滴稳定；正弦曲线方程的具体参数对液滴的制备结果无大的影响，只要是相类似的波浪形图案就能起到稳定球的作用，能减轻后面的球对前面球的冲击)三部分组成，其中水相入口与油相入口距离为8～10mm，水相入口与液滴出口距离为2～3cm，单条油相输运孔道与水相输运孔道交叉处的夹角为60°，油相入口、水相入口和液滴出口在同一直线上，孔道高度为50～100μm(两条油相孔道与液滴输送孔道类似于Y字形结构)；(3)将步骤(1)所获得的明胶预聚体与光引发剂2959溶于磷酸缓冲溶液(PBS)中，质量分数分别为5～10％与0.5～1％，作为水相从微流体液滴芯片的水相入口通入，流速为200μL～1000μL/h；将含有SPAN80的矿物油(CAS号为8020-83-5)作为油相从油相入口通入，流速为400μL/h～2000μL/h，矿物油中SPAN80的质量分数为10％～20％；液体通入后，水相与油相在孔道交叉处相遇进而发生微乳化，水相被油相切割形成微米级液滴，经液滴输运孔道由液滴出口流出，得到明胶预聚体微球；(4)将步骤(3)得到的明胶预聚体微球经紫外光灯曝光3min～5min后，依次经矿物油、含有TWEEN20的PBS溶液(TWEEN20的体积分数为0.5～1％)、PBS溶液清洗，然后加入到多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中(多巴胺的质量分数为2～4mg/mL，Tris-HCl缓冲溶液浓度为10～100mM)浸泡12h～72h，取出后再经PBS充分清洗后，得到本专利技术所述的用于细胞载体的多巴胺修饰的明胶微球，进而用于细胞接种。步骤(1)所使用的明胶为猪皮明胶或鱼皮明胶，所使用的渗析带材质为纤维素，截留分子量为8000～15000Da。步骤(2)中光刻胶为AZ5214、BP212-37s、BP212-45等，显影液为光刻胶配套显影液；紫外曝光灯波长为365nm，功率为30～100w。步骤(2)中等离子体刻蚀的刻蚀气压为6mTorr，刻蚀温度10℃，刻蚀功率为RF为50W，ICP为100W，刻蚀时间为2～3min，刻蚀深度为100～150μm。使用的刻蚀气体为氧气、三氟甲烷/六氟化硫、三氟甲烷/氩气等单独气体或多组分混合气体。步骤(3)中油相既可以是矿物油加SPAN80(SPAN80质量分数为10％～20％)，也可以是玉米油加软磷脂(软磷脂质量分数为1.5～3.0％)，成球过程中室温操作即可，不需要辅助加热装置。步骤(4)中球清洗过程中需要全程保证无菌，球清洗过程中，既可以用细胞筛网冲洗，也可以用离心清洗的方式。步骤(4)中接种的细胞既可以是神经元细胞，也可以是胚胎干细胞、神经干细胞、神经前体细胞均具有很好的促进黏附的效果。与现有技术相比，本专利技术的优点如下：1、本专利技术操作本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，其步骤如下：/n(1)4-(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体的制备：将8～15g明胶与1～2g的4-(二甲氨基)吡啶溶于40～60℃、80～150mL的二甲基亚砜中，待充分溶解后，在N
【技术特征摘要】
1.一种多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，其步骤如下：
(1)4-(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体的制备：将8～15g明胶与1～2g的4-(二甲氨基)吡啶溶于40～60℃、80～150mL的二甲基亚砜中，待充分溶解后，在N2保护的环境下向其中加入3～5mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应60～80小时后取出倒入渗析带，在30～50℃下去离子水渗析2～4天，将得到的渗析液冻干后放入-90～-70℃环境保存，得到4-(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体；
(2)微流体液滴芯片制备：微流体液滴芯片经基片处理、旋涂光刻胶、紫外掩模版曝光、等离子刻蚀、聚二甲基硅氧烷翻模、孔道键合等步骤制备得到；孔道结构由水相入口及水相输运孔道、油相入口及两条对称分布在水相输运孔道两侧、距离水相输运孔道最大平行距离为6～8mm的油相输运孔道、液滴出口及液滴输运孔道三部分组成，其中水相入口与油相入口距离为8～10mm，水相入口与液滴出口距离为2～3cm，单条油相输运孔道与水相输运孔道交叉处的夹角为60°，油相入口、水相入口和液滴出口在同一直线上，孔道高度为50～100μm；水相输运孔道为宽度100～200μm，长度6～8mm的直线型孔道；油相输运孔道为宽度100～200μm，长度2～3cm的折线型孔道；液滴输运孔道为宽度300～500μm，长度3～4cm的正弦曲线型孔道；
(3)将步骤(1)所获得的明胶预聚体与光引发剂2959溶于磷酸缓冲溶液(PBS)中，质量分数分别为5～10％与0.5～1％，作为水相从微流体液滴芯片的水相入口通入，流速为200μL～1000μL/h；将油相从油相入口通入，流速为400μL/h～2000μL/h；液体通入后，水相与油相在孔道交叉处相遇进而发生微乳化，水相被油相切割形成微米级液滴，经液滴输运孔道由液滴出口流出，得到明胶预聚体微球；
(4)将步骤(3)得到的明胶预聚体微球经紫外光灯曝光3min～5min后，依次经矿物油、含有TWEEN20的PBS溶液、PBS溶液清洗，然后加入到多巴胺的Tri-HCl缓冲溶液中浸泡12h～72h，取出后再经PBS溶液充分清洗...
【专利技术属性】
技术研发人员：张俊虎，唐晓铎，孙漪涵，杨柏，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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