低温保存方法和设备技术

本发明专利技术涉及用于低温保存生物样品的包含密度辅助式玻璃化的方法和设备，其中，低温保存制剂中的生物材料样品从其顶表面冷却，致使冰层形成在其上。随着冷却的继续，冰层穿过样品向下生长以在冰层下方提供低温防护剂和生物材料富含层，该层随着冷却继续至低于玻璃化转变温度而经历玻璃化。

Low temperature preservation method and equipment

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】低温保存方法和设备
本专利技术涉及用于低温保存在低温保存介质中的生物材料的包含密度辅助式玻璃化的方法、用于执行这些方法的设备以及通过这些方法所保存的样品。
技术介绍
低温保存是一种用于保存生物材料（例如，生物样品）的技术，其包括将样品冷却至非常低的温度（例如，-80°C、-136°C或-196°C），并且将它们长时间周期地维持在该温度。通过将生物样品冷却至低温，否则会使该样品劣化的化学或酶促反应的动力学被减慢至此种程度，也即该样品不再劣化或仅以非常慢的速率劣化。因此，生物样品可长时间周期地储存并且然后可根据使用和/或分析的需要而回复至环境温度。然而，冷却过程可对生物样品具有不利影响并且为减轻这些影响，已开发出许多用于低温保存的技术，尽管所有这些技术都具有固有的局限性。传统的低温保存技术涉及受控冷却并且导致冰晶的形成。一种备选的无冰技术，也即玻璃化，避免了在冷却期间冰晶的形成并且代替的是涉及使水固化成无定形玻璃。在低温保存过程期间对生物样品的损害主要地发生在冷却/冷冻阶段和加温阶段期间。溶液效应、细胞外冰的形成、细胞内冰的形成、膜效应、溶质毒性以及脱水都可导致样品损害。通过在低温保存循环期间引入具有已知保护性效果的化合物，可降低这些效应中的一些。在低温保存期间具有保护性效果的化合物称为低温防护剂或低温保护性添加剂（CPA）。存在生物样品在低温保存期间可遇到的各种应力，这些应力及其对细胞水平影响的实例包括i）温度的降低–可潜在地引起膜脂相和/或细胞骨架解聚方面的变化；ii）溶质浓度的增加（例如，溶液中溶质的浓度随着溶剂的一部分冷冻而增加）–可导致渗透性收缩；iii）离子浓度的增加–可对膜具有直接影响，包括膜蛋白质的溶化；iv）脱水–可引起脂双层不稳定；v）盐的沉淀和共晶体的形成–可引起细胞损伤，尽管机理尚未很好地理解；vi）气泡的形成–可引起机械损伤；vii）粘度的增加–可影响包括渗透的扩散过程；viii）pH值变化–可引起蛋白质的变性等；以及ix）细胞变得紧密密集-可引起膜损伤。因此，需要有最大限度地减小生物样品经受这些各种应力的低温保存技术。在标准的低温保存技术（有时称为常规低温保存或平衡低温保存）中，细胞或生物质在受控速率的冷冻机中以特定速率或通过使用更简单的被动冷却装置冷却。当样品温度下降低于其平衡融点（meltingpoint）时，冰开始形成（成核）并且冰晶然后从成核点扩散遍及样品，从而常常导致无法弥补的损害。随着冰形成过程的进行，生物样品例如细胞聚集在冰之间的溶质稠密通道中，直至这些通道本身固化（通过玻璃化），并且然后样品储存在其指定的储存温度下。由于可发生直接冰损害，故这些存在冰的低温保存技术通常认为不适用于保存组织和器官。简而言之，冰晶可在细胞之间扩张或生长成细胞，造成组织宏观结构的破坏，并且因此造成组织功能的破坏。实际上，尽管一些细胞外冰可支承在器官和组织中，但细胞内冰几乎总是对细胞是致命的。迄今为止，在存在冰的系统中已成功地低温保存的仅有哺乳动物器官是绵羊卵巢，并且这些明显比大多数器官或实际上是组织工程构建体小得多（参见Campbell等人，HumanReproduction2014Aug；29（8）：1749–1763）。尽管常规低温保存是一种用于大量应用的经证明的技术，但其应用通常受限于细胞或小聚合体的悬浮液。对于按体积计大于1mm3的活组织检查组织（biopsy）样品例如组织、器官或多细胞机体而言，由于冰的损害，故在冷冻和解冻期间发生了对材料不可接受的损害。与平衡低温保存相比，玻璃化是一种无冰低温保存技术。各种机理在玻璃化中采用以避免在冷却时冰的生长。玻璃化依赖于使驻留在玻璃化/低温保存介质中的样品低于该玻璃化/低温保存介质的玻璃化转变温度（Tg）而不允许冰晶形成。在温度低于玻璃化转变温度下，系统的粘度增加并且溶剂/介质最终固化以提供稳定的样品，在其中生物材料存在于无定形固体玻璃化/低温保存介质的低温基质中。经由玻璃化的低温保存通常需要在冷却之前向生物样品添加包含低温保存介质的低温防护剂（CPA），其降低介质和样品含水组分的冷冻温度并且还增加样品含水组分的粘度，使得在低于平衡凝固（或冷冻）点的冷却期间得以避免冰晶形成并且从液态到固态的转变不涉及结晶。然而，生物样品的玻璃化典型地需要快速冷却，例如冷却速率为10,000°C/min或更高，而这固有地将该方法限制于非常小的样品大小。典型地，玻璃化样品提供在内径为1mm或更小的吸管中。利用形成当前技术水平的技术通过玻璃化成功地低温保存较大的样品是非常困难或不可能的。玻璃化也可通过快速冷却和同时施加高压相结合来实现，但这涉及高成本和需要熟练的操作人员。冷却前在玻璃化过程中添加高浓度的溶质例如二甲亚砜（DMSO）可能是有用的，然而常常观察到所得溶液对生物样品的毒性，同时将这些高粘度液体灌注/扩散到复杂组织中也会很困难。用以玻璃化的另一方法（称为逐步降低温度（PLT）或液相线跟踪）涉及在冷却期间增加低温防护剂例如DMSO到低温保存介质中的浓度以防止冰形成和用以降低或消除与在液相线跟踪方法中所获得的CPA最终浓度相关联的任何毒性，该毒性将在冷却开始之前（例如，在环境温度下）显示出来，用以随着冷却的继续而最终地提供玻璃化样品。尽管该技术在1960年代首次在理论上提出，但由于各种技术难题，对该技术用于临床样品的成功实践应用仍未实现。对于这种方法未能发展成为成功技术的主要原因在于该过程进行所需的时间，以及在低温下与高溶质浓度所遇到的极高粘度。例如，在低温下所遇到的粘稠液体（例如具有高浓度DMSO的水溶液）变得非常难以泵送并且没有商业装备来实施这种方法。迄今为止，液相线跟踪主要地以逐步的方式进行。样品被添加至CPA溶液，该溶液然后下降至恰高于其凝固点。样品然后移动至具有更高CPA浓度（且因此具有较低凝固点）的溶液，该溶液然后冷却至新的凝固点，并且这继续进行直至样品处于足以玻璃化的浓度。在这种逐步的方法中，遇到了与溶质遗留（carryover）相关联的问题。此外，低温防护剂在低温下扩散到生物样品中（其对于实现整个样品的玻璃化是必不可少的）变得是速率限制的。液相线追踪在无菌条件下也难以实施，即使这是用于保存生物样本的必要条件。已经证明，哺乳动物胚胎和卵母细胞在少量液体中的玻璃化（无冰低温保存）在保持细胞成活力和功能方面是有效的。然而，尽管进行了广泛的研究，但尚未证明较大生物样品的玻璃化用以在加温时保持结构、成活力和功能，这看起来主要是由于在实现足够快的冷却/加温速率、避免冰成核和最大限度地降低低温防护剂毒性方面的实践困难。从患者或培养物中移除后，许多组织和组织工程器官不具有任何贮藏寿命。这导致浪费并且损害使用这些材料的技术的经济性并且因此对于组织工程构建体而言，即时制造通常是不可行的。因此，需要用于更好保存的方法，例如文中所述的那些。活组织检查组织具有许多直接的医学应用，一般地临床活组织检查组织是在获取后“快速地”冷冻并且然后在低温恒温器中切片，然而严重的冰损害使得对结构的判读变得非常困难并且存活细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在低温保存介质中低温保存包括生物材料的初始液体样品的方法，所述方法包括以下步骤：冷却所述样品的顶表面以在所述样品的顶表面处选择性地形成冰层。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171012 GB 1716729.71.一种用于在低温保存介质中低温保存包括生物材料的初始液体样品的方法，所述方法包括以下步骤：冷却所述样品的顶表面以在所述样品的顶表面处选择性地形成冰层。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括另一步骤，也即冷却所述样品以在所述顶表面处从所述冰层逐渐地向下朝向生物材料的基部提供冰的形成，所述生物材料基本上定位或浓缩在所述基部处。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，持续施加对所述样品的顶表面的冷却，直至所述样品在所述冰层下方的层凝固为玻璃，例如用以形成玻璃化层或无定形固体层作为冷却低于玻璃化转变温度的结果。


4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：将所述样品在所述冰层下方的层冷却至温度恰好高于所述冰层的温度，例如高于所述冰层的温度少于5℃的温度。


5.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述低温保存介质为包含至少一种低温防护剂的水溶液，所述至少一种低温防护剂选自以下各项：二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、C1-C3醇、1,2-异丙二醇、1,2-丙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、葡萄糖、单糖、二糖(例如蔗糖、海藻糖和乳糖)、多糖(例如棉子糖和葡聚糖)、聚蔗糖、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮。


6.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述低温保存介质包括DMSO、或者糖、或者DMSO与糖的组合。


7.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：在所述样品的顶表面上的冰锋已形成之后，将附加的低温防护剂添加至所述样品在所述冰层下方的层。


8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，根据所述冰层或在所述冰层下方的样品液体的温度降低以渐进的方式添加所述附加的低温防护剂。


9.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，在冷却期间对所述样品施加机械搅动。


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过经由以导热部件的形式位于所述样品中的冷却元件的热传导来提供冷却。


11.一种用于执行根据任一前述权利要求所述的低温保存方法的低温保存设备(1)。


12.根据权利要求11所述的设备，其特征在于，所述设备包括壳体(10，37)，所述壳体包括腔体(12，34)和初级冷却元件(18)，所述初级冷却元件结合在所述壳体位于所述腔体上方的顶板(16)中。


13.根据权利要求11所述的设备，其特征在于，所述壳体例如通过真空或部分真空(33)被绝缘。


14.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：P基尔布里德，GJ莫里斯，
申请(专利权)人：阿西姆普托特有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB