一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法，依次包括以下步骤：获取高原林蛙皮肤，然后在固定液中固定，再剪取得固定皮肤；将固定皮肤用二甲苯透明，然后浸入液体石蜡浸蜡，再包埋在石蜡中，最后；对冷藏后的皮肤进行切片，再贴片后烤片；将烤片用二甲苯洗片，然后用梯度乙醇进行洗片，最后用双蒸水洗片；将切片用苏木精染色，用清水洗净后再用伊红染色，最后用清水洗净，得高原林蛙皮肤石蜡切片。本发明专利技术制片过程操作简单便捷，可以快速的获取高原林蛙皮肤石蜡切片，且切片质量较好，光学显微镜下可以清晰的观察到皮肤组织结构形态，有效解决了切片质量较差、染色效果差和结构不完整的问题。

Preparation of paraffin section of skin of Rana altiplana

【技术实现步骤摘要】
一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法
本专利技术涉及切片制备
，具体涉及一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法。
技术介绍
高原林蛙(Ranakukunoris)是青藏高原特有的两栖类动物，已适应青藏高原高海拔缺氧、强紫外线的自然环境。皮肤作为两栖类动物抵御外来有害物质侵袭，调节渗透压、维持体内环境稳定的主要器官，对两栖类适应生态环境具有重要的意义。对两栖类皮肤结构的研究主要基于石蜡切片和H.E染色技术，目前国内外许多学者采用石蜡切片技术对两栖类动物皮肤结构做了大量的研究，但有关青藏高原东北部地区高原林蛙的研究还未见诸报道。且高原林蛙皮肤较薄，现有的石蜡切片技术很难切出符合要求的石蜡切片，操作复杂繁琐，所得切片质量较差，结构不完整，染色效果较差，无法清楚的观察其组织结构，为后续研究带来困难。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法，制片过程操作简单便捷，可以快速的获取高原林蛙皮肤石蜡切片，且切片质量较好，光学显微镜下可以清晰的观察到皮肤组织结构形态，有效解决了切片质量较差、染色效果差和结构不完整的问题。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法，依次包括以下步骤：(1)获取高原林蛙皮肤，然后在固定液中固定20～26h，再剪取，得固定皮肤；(2)将步骤(1)所得固定皮肤用100vt％二甲苯透明1～3次，每次20～40min，然后浸入50～70℃的液体石蜡，浸蜡1～3次，每次5～7h，再包埋在石蜡中，最后在3～5℃温度下冷藏10～14h；(3)对步骤(2)冷藏后的皮肤进行切片，再贴片后在40～45℃温度下烤片22～26h；(4)将步骤(3)所得烤片用100vt％二甲苯洗片4～6min，然后用梯度乙醇进行洗片，每次洗片4～6min，最后用双蒸水洗片4～6min；(5)将步骤(4)所得切片用苏木精染色2～4min，用清水洗净后再用伊红染色4～6min，最后用清水洗净，得高原林蛙皮肤石蜡切片。进一步，固定液为Bouin’s固定液。进一步，步骤(2)中，固定皮肤用100vt％二甲苯透明2次，每次30min。进一步，步骤(2)中，浸入60℃的液体石蜡，浸蜡2次，每次6h。进一步，步骤(3)中，采用徕卡石蜡切片机进行切片，切片方向与身体长轴方向垂直，且切片厚度为4～6μm。进一步，步骤(4)中，依次用无水乙醇、95vt％乙醇、70vt％乙醇、50vt％乙醇、30vt％乙醇进行洗片。进一步，步骤(3)中，切片后每隔10张选取1张。进一步，步骤(1)中，将高原林蛙皮肤剪取为1.5mm×2.5mm的长方形样块。综上所述，本专利技术具有以下优点：1、本专利技术提供的方法制片过程操作简单便捷，可以快速的获取高原林蛙皮肤石蜡切片，且切片质量较好，光学显微镜下可以清晰的观察到完整的组织结构形态，有效解决了切片质量较差、染色效果差和结构不完整的问题，便于后续研究的进行。2、制备时先将高原林蛙皮肤组织切下后在Bouin’s固定液中固定，使高原林蛙皮肤中所有细胞定型，后剪去小部分样品展平，后用二甲苯透明，转入石蜡中浸蜡后换蜡重新浸蜡一次，将样品立在样品盒内，石蜡包埋。将样品放入4℃冰箱，冷藏后既可以保持石蜡脆性，又不损伤较薄的皮肤组织。切片后在烤片机上烤片20～26h，烤片时间太短样品无法固定，时间太长样品容易损坏。3、染色时先用苏木精染色，后用清水洗干净，避免苏木精染色时间过长影响伊红上色，再用伊红进行染色，再洗去，完成染色后即可获取细胞结构完整的高原林蛙皮肤石蜡切片，对染色后的切片在显微镜下观察可看出，高原林蛙皮肤结构包括表皮层和真皮层。4、制备得到的高原林蛙皮肤石蜡切片可以清楚的看到其组织架构，黏液腺在背部和腹部皮肤内基本分布均匀，形态似泡状，经伊红染色后呈现淡紫色；颗粒腺散布在体背皮肤中，多以团状形式存在，腺体较大，经伊红染色呈红色；嗜酸腺位于接近表皮层的一侧真皮层内，大小与黏液腺基本一致，大多内空，腺体边缘被染成红色，是林蛙体内发现的一种特殊腺体；色素细胞主要位于表皮和真皮中间位置，呈黑色，点状分布；毛细血管主要位于真皮疏松层，在表皮层也有少量分布，经伊红染色后可观察到内部半空的结构，其中非空的一半为红色。附图说明图1为高原林蛙皮肤组织结构示意图。具体实施方式实施例1一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法，依次包括以下步骤：(1)获取高原林蛙前肢皮肤，然后在Bouin’s固定液中固定20h，再剪取为1.5mm×2.5mm的长方形样块待用，得固定皮肤；(2)将步骤(1)所得固定皮肤用100vt％二甲苯透明1次，每次20min，然后浸入50℃的液体石蜡，浸蜡1次，每次5h，再包埋在石蜡中，最后在3℃温度下冷藏10h；(3)对步骤(2)冷藏后的皮肤采用徕卡石蜡切片机进行切片，切片方向与身体长轴方向垂直，且切片厚度为4～6μm，再贴片后在40℃温度下烤片22h；(4)将步骤(3)所得烤片用100vt％二甲苯洗片4min，然后依次用无水乙醇、95vt％乙醇、70vt％乙醇、50vt％乙醇、30vt％乙醇进行洗片，每次洗片4min，最后用双蒸水洗片4min；(5)将步骤(4)所得切片用苏木精染色2min，用清水洗净后再用伊红染色4min，最后用清水洗净，得高原林蛙皮肤石蜡切片。实施例2一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法，依次包括以下步骤：(1)获取高原林蛙背部皮肤，然后在Bouin’s固定液中固定24h，再剪取为1.5mm×2.5mm的长方形样块待用，得固定皮肤；(2)将步骤(1)所得固定皮肤用100vt％二甲苯透明2次，每次30min，然后浸入60℃的液体石蜡，浸蜡2次，每次6h，再包埋在石蜡中，最后在4℃温度下冷藏12h；(3)对步骤(2)冷藏后的皮肤采用徕卡石蜡切片机进行切片，切片方向与身体长轴方向垂直，且切片厚度为4～6μm，再贴片后在42℃温度下烤片24h；(4)将步骤(3)所得烤片用100vt％二甲苯洗片5min，然后依次用无水乙醇、95vt％乙醇、70vt％乙醇、50vt％乙醇、30vt％乙醇进行洗片，每次洗片5min，最后用双蒸水洗片5min；(5)将步骤(4)所得切片用苏木精染色3min，用清水洗净后再用伊红染色5min，最后用清水洗净，得高原林蛙皮肤石蜡切片。实施例3一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法，依次包括以下步骤：(1)获取高原林蛙头部皮肤，然后在Bouin’s固定液中固定26h，再剪取为1.5mm×2.5mm的长方形样块待用，得固定皮肤；(2)将步骤(1)所得固定皮肤用100vt％二甲苯透明1～3次，每次40min，然后浸入70℃的液体石蜡，浸蜡3次，每次7h，再包埋在石蜡中，最后在5℃温度下冷藏14h；...

【技术保护点】
1.一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：/n(1)获取高原林蛙皮肤，然后在固定液中固定20～26h，再剪取，得固定皮肤；/n(2)将步骤(1)所得固定皮肤用100vt％二甲苯透明1～3次，每次20～40min，然后浸入50～70℃的液体石蜡，浸蜡1～3次，每次5～7h，再包埋在石蜡中，最后在3～5℃温度下冷藏10～14h；/n(3)对步骤(2)冷藏后的皮肤进行切片，再贴片后在40～45℃温度下烤片22～26h；/n(4)将步骤(3)所得烤片用100vt％二甲苯洗片4～6min，然后用梯度乙醇进行洗片，每次洗片4～6min，最后用双蒸水洗片4～6min；/n(5)将步骤(4)所得切片用苏木精染色2～4min，用清水洗净后再用伊红染色4～6min，最后用清水洗净，得高原林蛙皮肤石蜡切片。/n

【技术特征摘要】
1.一种高原林蛙皮肤石蜡切片的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
(1)获取高原林蛙皮肤，然后在固定液中固定20～26h，再剪取，得固定皮肤；
(2)将步骤(1)所得固定皮肤用100vt％二甲苯透明1～3次，每次20～40min，然后浸入50～70℃的液体石蜡，浸蜡1～3次，每次5～7h，再包埋在石蜡中，最后在3～5℃温度下冷藏10～14h；
(3)对步骤(2)冷藏后的皮肤进行切片，再贴片后在40～45℃温度下烤片22～26h；
(4)将步骤(3)所得烤片用100vt％二甲苯洗片4～6min，然后用梯度乙醇进行洗片，每次洗片4～6min，最后用双蒸水洗片4～6min；
(5)将步骤(4)所得切片用苏木精染色2～4min，用清水洗净后再用伊红染色4～6min，最后用清水洗净，得高原林蛙皮肤石蜡切片。


2.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：张湑泽，沈迎芳，彭飞，侯业茂，孙玉奇，
申请(专利权)人：青海民族大学，
类型：发明
国别省市：青海;63