基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法，采用静态液滴阵列将预分离的细胞液分隔成若干个液滴，然后将液滴表面用相容性生物油覆盖，吸取出单个细胞。本发明专利技术所述的方法是利用微流控技术中常见的静态液滴阵列，将细胞溶液注射进入静态液滴阵列后，细胞溶液会被分割成若干个液滴，液滴通过生物相容性油包裹成可以移动的液滴，从而可以挑选出这些移动的液滴中只有单个细胞的液滴。

Isolation of single cell based on static droplet array

【技术实现步骤摘要】
基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法
本专利技术涉及细胞提取
，尤其涉及一种基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法。
技术介绍
细胞间的异质性在近几年受到了越来越多的关注。即使在同一组细胞里，不同的基因、蛋白质表达量会对实验和诊断结果的准确性造成极大的影响，因此，单个细胞分析变成了新的研究热点。微流控技术因其可实现对微尺度流体的精确操控，为单分散非球形微粒的可控制备提供了优良的实验平台，显示出巨大的应用潜力。由于其低成本，高精度，自动化，低污染，高通量等特性，在少量样品的分析上有广阔的前景。现有的单个细胞分离技术包括动态液滴生成和静态液滴生成技术。这两种方法都采用了二甲基硅氧烷(dimethylsiloxane，PDMS)生产的设备。目前，市面上共有五个公司用液滴产生器(dropletgenerator)进行单个细胞分析。他们分别是：Celsee，10Xgenomics,1cellbio,和MissionBio。另外还有一个公司用静态液滴阵列进行单个细胞分析(fluidigm)。液滴产生器每分钟能产生多达十万个液滴。把细胞溶液稀释到合适的浓度后，就有一定几率能在一个液滴中只包裹一个细胞。但是这个方法的缺陷是，绝大多数的液滴都是空的，只有不到1％的液滴中会只含有一个细胞。不仅如此，由于使用和流式细胞仪相似的通道技术，达到稳定的单个细胞液滴生成需要至少2000个细胞。对于数量比较稀少的样本，比如循环癌细胞(circulatingtumourcell,CTC)来说，这项细胞利用率低的技术会浪费珍贵的细胞样本，以至于无法分析。液滴产生器分离后的细胞会被收集在一个共同的容器中，虽然可以通过带有条形码的微粒子提取到单个细胞的数据，却不能够对取出的单个细胞进行别的操作。Fluidigm的静态液滴阵列抓取率高，并且适用于小量细胞样本。但是由于液滴尺寸恒定，对不同细胞的适用面窄。最大的问题是设备的消耗品价格高昂，对96个细胞进行分析需要至少1500美元。此外，无论是哪种技术，在进行单个细胞分离之后都只能对细胞执行特定的操作，例如PCR，基因测序。两种技术都没有办法对同次分析中的不同细胞执行不同操作。换言之，现有的技术不能够自由处理任意被分离的细胞，只能够在限定的条件下进行操作。在实验室中，各个实验室自己设计的静态液滴阵列被大量地运用在数十到数百个细胞的样品的单个细胞分析中，但是由于同样的接触不到细胞本身，只能够进行染色，基因测序等少数几种实验。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的专利技术目的在于提供一种基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法，通过微流控技术中常见的静态液滴阵列，将注射进入静态液滴阵列被分割成若干个液滴，实现细胞自由取出和使用。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案内容具体如下：基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法，采用静态液滴阵列将预分离的细胞液分隔成若干个液滴，然后将液滴表面用相容性生物油覆盖形成油包覆液滴，从油包覆液滴中吸取出单个细胞的液滴。作为进一步优选的方案，本专利技术所述的基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法包括细胞液注入到静态液滴阵列的步骤：将静态液滴阵列放置基材上，然后注入细胞液；液滴分割步骤：从静态液滴阵列的出口处吸出主通道中的液体，或从入口处注非液相物质把静态液滴阵列隔间中的液体分割成多个液滴；冷冻步骤：将上述液滴分割后的静态液滴阵列放入冷冻环境中速冻处理，同时将准备好的生物相容性油放入到同一个冷冻环境中；液滴分离步骤：将上述经过速冻处理后的液滴从静态液滴阵列或基材上分离出来，并迅速将上述经过冷冻后的生物相容性油覆盖在液滴表面，防止蒸发；吸取液滴步骤：用微量移液工具吸取液滴。作为进一步优选的方案，本专利技术所述的基材包括软质基材或硬质基材。作为进一步优选的方案，本专利技术所述的基材为培养皿，载玻片或者封口膜中的一种。作为进一步优选的方案，本专利技术中注入静态液滴阵列中的细胞浓度为20-100细胞/μL。作为进一步优选的方案，本专利技术所述的冷冻环境为-20℃到-80℃的干冰环境或冰箱或液氮环境中。作为进一步优选的方案，本专利技术所述的生物相容性油为矿物油或氟代烃油。作为进一步优选的方案，本专利技术所述的静态液滴阵列隔间的体积为20-60nL。作为进一步优选的方案，本专利技术所述的非液相物质为空气、氮气、油中的一种。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术所述的基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法通过微流控技术中常见的静态液滴阵列，将注射进入静态液滴阵列被分割成若干个液滴，液滴通过生物相容性油包裹成可以移动的液滴，从而可以挑选出这些移动的液滴中只有单个细胞的液滴。2.本专利技术所述的基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法解决了现有的单个细胞分离方法中提取细胞难的问题，具有成本低、操作简单的优点。3.本专利技术所述的基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法中，形成的液滴不像液滴生成器那样处于悬浮液中，而是具有固定的边界，该液滴可以进一步通过成像设备识别，应用于自动化的机器中。4.本专利技术所述的基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法中，进一步的方案中，采用低温急速冷冻，通过极速冷冻获得含有单个细胞的纳米级液滴，液滴冷却的速度足够快，即使不加入冷却保护剂依然可以避免伤害到细胞，解冻后细胞仍具有活性。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本专利技术的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。附图说明图1为本专利技术所述的方法的流程图。图2为通过本专利技术所述的方法分离出的单个细胞的电镜图，其中b为a的局部放大图。图3为细胞浓度对单细胞抓取率的影响结果图。图4为不同细胞株的单细胞间的同个基因表达量对比图。图5为单个细胞与十个细胞间的不同基因表达量对比图。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术为达成预定专利技术目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本专利技术的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下：本专利技术所述的基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法，采用静态液滴阵列将预分离的细胞液分隔成若干个液滴，然后将液滴表面用相容性生物油覆盖形成油包覆液滴，从油包覆液滴中吸取出单个细胞的液滴。该方法是利用微流控技术中常见的静态液滴阵列，注射的细胞液被分割成若干个单个细胞的纳米级液滴。如图2中b所示，可以见到每个液滴中的单个细胞。作为进一步优选的方案，参见图1的流程图，本专利技术所述的基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法包括细胞液注入到静态液滴阵列的步骤：将静态液滴阵列放置基材上，然后注入细胞液；液滴分割步骤：从静态液滴阵列的出口处吸出主通道中的液体，或从入口处注非液相物质把静态液滴阵列隔间中的液体分割成多个液滴；冷冻步骤：将上述液滴分割后的静态液滴阵列放入冷冻环境中速冻处理，同时将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法，其特征在于，采用静态液滴阵列将预分离的细胞液分隔成若干个液滴，然后将液滴表面用相容性生物油覆盖形成油包覆液滴，从油包覆液滴中吸取出单个细胞的液滴。/n

【技术特征摘要】
1.基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法，其特征在于，采用静态液滴阵列将预分离的细胞液分隔成若干个液滴，然后将液滴表面用相容性生物油覆盖形成油包覆液滴，从油包覆液滴中吸取出单个细胞的液滴。


2.根据权利要求1所述的基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法，其特征在于，具体包括
细胞液注入到静态液滴阵列的步骤：将静态液滴阵列放置基材上，然后注入细胞液；
液滴分割步骤：从静态液滴阵列的出口处吸出主通道中的液体或从入口处注非液相物质把静态液滴阵列隔间中的液体分割成多个液滴；
冷冻步骤：将上述液滴分割后的静态液滴阵列放入冷冻环境中速冻处理，同时将准备好的生物相容性油放入到同一个冷冻环境中；
液滴分离步骤：将上述经过速冻处理后的液滴从静态液滴阵列或基材上分离出来，并迅速将上述经过冷冻后的生物相容性油覆盖在液滴表面，防止蒸发；
吸取液滴步骤：用微量移液工具吸取液滴。


3.根据权利要求1所述的基于静态液滴阵列分离单个细胞的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁林，马吉德，
申请(专利权)人：丁林，
类型：发明
国别省市：广东;44