本发明专利技术公开了一种磁性固定化酵母细胞及其在制备(R)‑2‑羟基‑4‑苯基丁酸乙酯中的应用，所述磁性固定化酵母细胞是将赖氨酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞溶液混匀，20℃‑40℃、130‑170r/min摇床震荡中固定2‑6h，反应结束后，磁分离，沉淀用去离子水洗涤，冻干，获得磁性固定化酵母细胞。本发明专利技术固定化方法有效提高了酵母细胞的稳定性，增强了细胞对底物溶液的耐受性。在外加磁场的作用下磁性固定化细胞更易于从反应体系分离，有利于产物的分离提取，简化了工艺流程。在交变磁场反应器中合适的磁场频率和磁场强度能有效增强反应体系的传质过程，显著缩短还原反应时间，进而提高生物转化效率。
Magnetic immobilization of yeast cells and its application in the preparation of ethyl (R) - 2-hydroxy-4-phenylbutyrate
【技术实现步骤摘要】
磁性固定化酵母细胞及其在制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用(一)
本专利技术涉及一种(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备，特别涉及到使用氨基酸修饰的磁性纳米颗粒作为载体有效固定化酵母，并将其用于2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。(二)
技术介绍
(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(Ethyl(R)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate，R-HPBE)，CAS号90315-82-5，分子式C12H16O3，分子量208.25，密度为1.075g/mL，沸点为212℃，不溶于水，易溶于有机溶剂。R-HPBE是合成赖诺普利、喹那普利、雷米普利、西拉普利等血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类抗高血压和充血性心力衰竭药物的重要手性中间体，不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)可以制备R-HPBE。高血压病是一种由于血管神经调节障碍而升高动脉压力的慢性疾病，随着生活水平的提高，中、老年人已成为该病的多发人群，高血压影响血管脆性，过度时会引起血管破裂等问题，并引发心脑血管疾病，肾脏病、眼底疾病、神经系统疾病等，更为严重的是高血压还与高血糖、高血黏度、高血脂等疾病紧密联系在一起，造成全身各组织器官的慢性损害，导致身体脏器功能丧失，严重威胁人们的生命与健康。普利类药物由于其高效性和低副作用成为目前市场上主要的抗高血压药物，占高血压等疾病治疗药物市场的五分之一。R-HPBE在合成普利类药物(ACEI)中具有关键作用，ACEI药物通过切断肾素-血管紧张素-醛固酮系统，阻断血管紧张素Ⅱ的生成从而达到扩张血管、降血压的作用。故R-HPBE的制备方法在国内外引起众多关注，近几十年来不断有人致力于新的R-HPBE的制备技术路线研发，以期获得一条经济、原子利用率高的绿色合成工艺。采用化学法和生物法不对称还原OPBE均可以制备R-HPBE。化学法包括化学拆分法和化学合成法，化学拆分法是拆分其相应外消旋体2-羟基-4-苯基丁酸，再酯化为R-HPBE，所用拆分剂为手性有机胺类化合物，化学拆分法存在的问题有：以光学纯苯乙胺类衍生物作拆分剂，由于其价格昂贵，实用价值不大；而氯霉素中间体拆分收率较低(小于50％)。而传统的化学合成法往往步骤繁多，催化剂价格较贵，环境污染严重，产物对映体过剩值不高，且催化反应需要很高的氢气压力，对设备要求高。而生物法因其光学选择性高、反应条件温和、环境友好等特性，成为目前合成R-HPBE最有效的方法之一。生物合成法包括全细胞不对称还原法和羰基还原酶转化法。采用羰基还原酶不对称还原OPBE，需要提纯羰基还原酶并添加辅酶提高转化率，转化底物的量偏低。利用微生物全细胞催化还原反应是目前国际上制备R-HPBE有效且极有发展前景的方法之一，该方法反应条件温和、环境友好，成本低廉，催化效果理想，且反应体系可实现辅酶原位再生，具有良好的工业应用前景。但是，该方法需进一步解决的问题是提高反应的底物浓度，降低对细胞的抑制作用以及提高细胞对底物和有机溶剂的耐受性。为了提高细胞的耐受性和稳定性，本专利技术拟采用磁性固定化细胞转化OPBE制备R-HPBE，提高催化剂的重复利用次数，实现连续反应，提高生产效率。与游离细胞相比，固定化细胞多次使用而没有明显的活性损失，具有较高的经济性。固定含有特定酶的细胞消除了分离和纯化酶的漫长而繁琐的程序，易于产物纯化，方便催化剂的回收利用。由于固定在载体上的生物催化剂无需重新填充，保留在载体上的微生物可实现连续生产。对于非磁性载体固定化细胞的应用，存在着必须离心操作，样品不得不稀释及载体回收损失大等问题，因此，寻求更好的固定化细胞载体成了人们研究的热点。磁性载体不仅能有效避免以上问题，且因其具有颗粒小、超顺磁性、低毒性和借助外部磁场易从体系中分离等特点，引起了研究者的关注。磁性固定化后的细胞拥有更好的稳定性和重复利用性，在生物催化反应中，固定化细胞拥有更好的催化效率和立体选择性，有利于反应的连续进行。本专利技术通过筛选对前手性酮2-氧代-4-苯基丁酸乙酯具有高催化活性的微生物菌株，并用自制的磁性载体将其固定化得到固定化细胞，在摇床中利用细胞内的选择性羰基还原酶对前手性底物OPBE进行不对称还原，制备生成血管紧张素转换酶抑制剂合成中的重要手性关键体R-HPBE，并最大限度地提高产物的光学纯度和产率。本专利技术首次在磁场实现磁性固定化细胞不对称还原OPBE得到R-HPBE，工艺流程简单、操作方便、催化效率高，为R-HPBE的制备提供简便可行途径，并且为高效生物催化合成具有重要应用前景的手性药物或重要中间体提供基础理论指导，具有较好应用前景。在反应器中，磁性固定化细胞在交变磁场作用下可以均匀分散在反应液中，实现充分的传质，磁场对磁性固定化颗粒的作用代替了传统的生物反应器的搅拌作用，使磁性固定化细胞与底物充分接触，减少传质阻力，提高反应速率。在磁场的作用下磁性固定化细胞更易于从反应液中分离，有利于产物的分离提取，解决了游离酵母细胞催化生物转化过程底物处理量偏低的问题，提高了酵母细胞的利用次数，进而提高生物转化效率。本专利技术的研究工作为进一步研究固定化技术在工业中的应用提供了新的思路，温和的固定化过程和易制备的载体大大降低了工业应用成本，对此领域相关研究起到推动作用。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种磁性固定化酵母细胞及其不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯高效制备R-HPBE的应用。通过筛选对前手性底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯具有高催化活性的酵母细胞，并进一步用自制磁性纳米载体高效固定目标酵母细胞，在最优条件下得到最大产量的固定化细胞，筛选摇床中生物转化条件得到高光学纯的R-HPBE。将固定化细胞进一步应用在交变磁场中利用磁场作用代替传统的搅拌作用，实现充分的传质，在最优的磁场条件下固定化细胞的催化活力最高，催化反应效率得到显著提高，从而建立磁性固定化细胞在磁场反应器中高效还原OPBE制备R-HPBE的工艺，为后期的工业应用提供了参考。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种磁性固定化酵母细胞，所述磁性固定化酵母细胞制备方法：(1)将Fe3O4磁性颗粒与氨基酸水溶液超声分散后，使用外加磁场回收沉淀，沉淀洗涤后冻干，获得氨基酸修饰磁性纳米粒子(记为Fe3O4-AA)；所述Fe3O4磁性纳米颗粒与赖氨酸水溶液中赖氨酸质量比为1:1；所述赖氨酸水溶液质量浓度为1g/L；所述超声分散条件为：20～50KHz超声30min；(2)将Fe3O4-AA与酵母细胞溶液混匀，20℃-40℃(优选30℃)、130-170r/min(优选150r/min)摇床震荡中固定2-6h(优选3h)，反应结束后，磁分离，沉淀用去离子水洗涤(优选三次)，冻干，获得磁性固定化酵母细胞(记为Fe3O4-AA-Cell)；所述Fe3O4-AA与酵母细胞干重比为1:50-300，优选1:100；所述酵母细胞溶液是将酵母细胞与pH7磷酸缓冲液充分混匀制成，所述缓冲液添加量以酵母细胞重量计为20ml/3g；所述冻干条件为：然后-80℃冰箱本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磁性固定化酵母细胞，其特征在于所述磁性固定化酵母细胞按如下方法制备：(1)将Fe
【技术特征摘要】
1.一种磁性固定化酵母细胞，其特征在于所述磁性固定化酵母细胞按如下方法制备：(1)将Fe3O4磁性颗粒与氨基酸水溶液超声分散后，使用外加磁场回收沉淀，沉淀洗涤后冻干，获得氨基酸修饰磁性纳米粒子；所述氨基酸为赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；(2)将氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞溶液混匀，20-40℃、130-170r/min摇床震荡中固定2-6h，反应结束后，磁分离，沉淀用去离子水洗涤后冻干，获得磁性固定化酵母细胞。
2.如权利要求1所述磁性固定化酵母细胞，其特征在于步骤(1)所述Fe3O4磁性纳米颗粒与氨基酸水溶液中氨基酸质量比为1:1；所述氨基酸水溶液质量浓度为1g/L。
3.如权利要求1所述磁性固定化酵母细胞，其特征在于步骤(1)所述超声分散条件为：20～50KHz超声30min。
4.如权利要求1所述磁性固定化酵母细胞，其特征在于步骤(2)所述氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞溶液中酵母细胞干重比为1:50-300；所述酵母细胞溶液是将酵母细胞与pH7磷酸缓冲液充分混匀制成，所述缓冲液添加量以酵母细胞干重计为20ml/3g。
5.如权利要求1所述磁性固定化酵母细胞，其特征在于步骤(2)所述冻干条件为：-80℃冰箱中预冻8h后，放入冷冻干燥机中冻干-65℃真空干燥12h。
6.一种权利要求1所述磁性固定化酵母细胞在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中...
【专利技术属性】
技术研发人员：欧志敏，卢媛，代洪倩，唐岚，杜理华，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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