一种黄芪中二硫键多肽的纯化和鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种从黄芪中富集多肽并进行鉴定的方法，是将经鉴定无误的干燥黄芪切片经醇液超声提取、过滤、浓缩、萃取、有机试剂富集黄芪中的多肽并通过烷基化处理、质谱分析及De Novo分析鉴定其中的二硫键多肽。本发明专利技术成功地将传统的植物化学分析方法、生物化学方法及质谱方法相结合进行多肽富集及检测，无需脱盐、超滤分离、特殊色谱柱填料等操作，步骤少、操作简便，为现代植物多肽的研究提供了技术参考及指导。

Purification and identification of disulfide peptide from Astragalus membranaceus

【技术实现步骤摘要】
一种黄芪中二硫键多肽的纯化和鉴定方法
本专利技术属于分离分析及生物
，具体涉及一种将传统植物提取方法与生物技术结合来富集鉴定二硫键多肽的方法。
技术介绍
黄芪，为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge的干燥根。始载于《神农本草经》，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌等作用。现代医学研究其具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗病毒、抗损伤、降血糖、治疗代谢紊乱等活性作用。研究最多的主要活性成分为黄酮类、皂苷类、多糖类成分。自然界中存在着大量的多肽类化合物，前人更多地关注于动物体中的多肽、蛋白类成分，而在植物中主要研究黄酮、蒽醌、三萜、皂苷、生物碱等类化合物。随着现代分离及分析技术的飞跃发展，越来越多的植物中多肽类化合物被鉴定得到，且实验研究发现许多植物多肽类成分具有较强的生物活性，这为新药研发带来了更多的可能性。目前，研究发现植物多肽具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老、提高免疫活性、降糖、修复神经损伤等方面的活性，继而开发了一些具有显著疗效的临床药物。自然界中存在的多二硫键肽(常含2-4对二硫键，分子量2500-4000)因为结构稳定、空间结构特殊而多具有重要的生理功能以及优异的成药特性。与线性多肽相比，多二硫键肽的种类有限，在动植物中分布稀疏，难以被发现；其结构稳定性高，骨架长，难以被通用的蛋白质组学手段进行序列及结构测定；尤其是多对二硫键形成的二硫键桥环难以被准确测定。这些因素，导致二硫键多肽的发现和结构鉴定成为活性多肽研究领域的一个难点。而植物多肽类药物具有广阔的发展前景，由于植物中成分复杂，多肽含量较少，有效分离纯化的方法较少等原因导致其发展受到了一定的限制，为改善这一限制条件，越来越多的分离、纯化、鉴定方法应运而生，并且取得了良好的效果。目前，多肽、蛋白的分离纯化方式还是需要依靠特殊处理，如：尿素提取、酶法制备等，操作较为繁琐，后处理过程较多。因此，发展一种有效、简便、快速分离纯化的方法是一项非常有价值的研究课题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄芪中二硫键多肽的纯化和鉴定方法，所述方法至少包括以下步骤：a)制备黄芪提取液；b)向所述黄芪提取液中加入萃取剂A，得到含有萃取剂A的萃取液和不含萃取剂A的萃取液；c)向所述不含萃取剂A的萃取液中加入醇类萃取剂B，得到含有醇类萃取剂B的萃取液和不含醇类萃取剂B的萃取液；d)将所述含有醇类萃取剂B的萃取液浓缩制得干燥物I,然后使所述干燥物I中与混合萃取液C接触，将所得沉淀物浓缩制得干燥物II；e)将所述干燥物II分成两等份干燥物II-1和干燥物II-2；f)将溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应，制得前驱体1；g)将所述前驱体1与碘乙酰胺接触，进行烷基化反应得到前驱体2；h)向所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应结束后除盐并进行干燥，得到干燥物III；i)采用质谱技术对所述干燥物II-1和所述干燥物III进行多肽检测分析在优选的实施方式中，将所述干燥物II-1的质谱数据用作所述干燥物III的二硫键的烷基化多肽质谱数据的内在对照。在优选的实施方式中，所述萃取剂A选自乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷中的至少一种优选地，所述萃取剂A与所述黄芪提取液的体积比为1:1。在优选的实施方式中，所述醇类萃取剂B为正丁醇。优选地，所述萃取剂B与所述萃取剂A的萃取液的体积比为1:1。在优选的实施方式中，其特征在于，所述混合萃取液C由醇类萃取剂正丁醇和二氯甲烷或氯仿组成。优选地，所述混合萃取液C中的醇类萃取剂与二氯甲烷的体积为：3～5:1。优选地，所述萃取剂选自正丁醇。优选地，所述混合萃取液C与所述干燥物I的溶液的体积比为1:4。在优选的实施方式中，步骤f)中，溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应在50～70℃下进行0.5～1.5小时。优选地，步骤f)中，所述溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应在水浴条件下进行。在优选的实施方式中，步骤g)中，所述前驱体1与碘乙酰胺接触反应在常温下进行3～5小时。在优选的实施方式中，步骤h)中，所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应在常温下进行0.5～1.5小时。在优选的实施方式中，所述黄芪提取液是固体黄芪样品的乙醇-水溶液；优选地，乙醇在所述乙醇-水溶液中的体积比为70％。在优选的实施方式中，所述质谱技术包括纳升液相-线性离子阱-静电场轨道离子阱联用质谱(Nano-LTQ-OrbitrapLC-MS/MS)或Q-TOFLC-MS/MS。优选地，所述质谱技术是Nano-LTQ-LC/MS。在优选的实施方式中，所述Nano-LTQ-LC/MS至少包括以下步骤：使用Trap柱进行等度洗脱，其中洗脱流动相由85％～98％H2O的A相和2％～15％乙腈的B相组成，流速2.5～3.2μl/分钟；使用Nano柱进行梯度洗脱，其中流速0.3μl/分钟，其中洗脱流动相由85％～98％H2O的A相和2％～15％乙腈的B相组成；之后依次进行：5％B洗脱0-5分钟，5～20％B洗脱5-10分钟，20～35％B洗脱10-20分钟，35～50％B洗脱20-45分钟，50～70％B洗脱45-55分钟，70～90％B洗脱55-60分钟，90％B洗脱60-70分钟，90％～5％B洗脱70-75分钟,5％B洗脱75-80钟，优选地，测试进样量为5μl。本申请能产生的有益效果包括：1)本专利技术提供了一种从黄芪中富集多肽并进行鉴定的方法，将富集得到的黄芪中的多肽进行处理，通过质谱分析及DeNovo分析可以鉴定其中的二硫键多肽。2)本专利技术成功地将传统的植物化学分析方法、生物化学方法及质谱方法相结合进行多肽富集及检测。为现代植物多肽的研究提供了的技术参考及指导。3)本专利技术的方法中无需脱盐、超滤分离、特殊色谱柱填料等操作，步骤少、操作简便。该方法具有快速、简单、有效、准确等优点，为植物多肽的研究提供一条可行的途径。附图说明图1示出不同提取方式逐步富集黄芪中多肽的结果；图2示出黄芪中二硫键多肽质谱鉴定结果。具体实施方式下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。在具体的实施方式中，从黄芪中富集多肽并进行鉴定的方法包括以下步骤：(1)粉碎干燥黄芪切片，每公斤药材粉末加入8倍体积70％乙醇-水溶剂，分2-3次在40℃超声浸提，每次1小时，抽滤一次，得黄芪提取液及滤渣；(2)将黄芪提取液浓缩至无醇，加入去离子水混悬，按照体积比1:1向混悬液中加入乙酸乙酯、得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；(3)取不含乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄芪中二硫键多肽的纯化和/或鉴定方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：/na)制备黄芪提取液；/nb)向所述黄芪提取液中加入萃取剂A，得到含有萃取剂A的萃取液和不含萃取剂A的萃取液；/nc)向所述不含萃取剂A的萃取液中加入醇类萃取剂B，得到含有醇类萃取剂B的萃取液和不含醇类萃取剂B的萃取液；/nd)将所述含有醇类萃取剂B的萃取液浓缩制得干燥物I,然后使所述干燥物I中与混合萃取液C接触，将所得沉淀物浓缩制得干燥物II；/ne)将所述干燥物II分成两等份干燥物II-1和干燥物II-2；/nf)将溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应，制得前驱体1；/ng)将所述前驱体1与碘乙酰胺接触，进行烷基化反应得到前驱体2；/nh)向所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应结束后除盐并进行干燥，得到干燥物III；/ni)采用质谱技术对所述干燥物II-1和所述干燥物III进行多肽检测分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种黄芪中二硫键多肽的纯化和/或鉴定方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：
a)制备黄芪提取液；
b)向所述黄芪提取液中加入萃取剂A，得到含有萃取剂A的萃取液和不含萃取剂A的萃取液；
c)向所述不含萃取剂A的萃取液中加入醇类萃取剂B，得到含有醇类萃取剂B的萃取液和不含醇类萃取剂B的萃取液；
d)将所述含有醇类萃取剂B的萃取液浓缩制得干燥物I,然后使所述干燥物I中与混合萃取液C接触，将所得沉淀物浓缩制得干燥物II；
e)将所述干燥物II分成两等份干燥物II-1和干燥物II-2；
f)将溶解有所述干燥物II-2的尿素溶液与二硫苏糖醇混合反应，制得前驱体1；
g)将所述前驱体1与碘乙酰胺接触，进行烷基化反应得到前驱体2；
h)向所述前驱体2中加入二硫苏糖醇，反应结束后除盐并进行干燥，得到干燥物III；
i)采用质谱技术对所述干燥物II-1和所述干燥物III进行多肽检测分析。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述干燥物II-1的质谱数据用作所述干燥物III的二硫键的烷基化多肽质谱数据的内在对照。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取剂A选自乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷中的至少一种；
所述醇类萃取剂B为正丁醇；
所述混合萃取液C由正丁醇和二氯甲烷或氯仿组成。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取剂A与所述黄芪提取液的体积比为1:1；
所述醇类萃取剂B与所述不含萃取剂A的萃取液的体积比为1:1；
所述混合萃取液C中的醇类萃取剂与二氯甲烷的体积为：3～5:1。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合萃取液C与所述干燥物I的溶液的体积比为1:4。


6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓哲，何枚羲，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21