一种龙葵果总生物碱的制备方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种龙葵果总生物碱提取物的制备方法，及其在制备治疗白血病药物中的用途。

Preparation and application of a total alkaloid from Solanum nigrum fruit

【技术实现步骤摘要】
一种龙葵果总生物碱的制备方法及其用途
本专利技术涉及生物碱提取物及其制备方法和在制备治疗白血病的药物中的用途，属于天然药物

技术介绍
龙葵果为茄科茄属植物龙葵(SolanumnigrumL.)的果实。据记载，在维药中龙葵果具有调血解毒、清热止渴、收敛消肿之功效，临床上常与其它中药组合应用发挥抗癌和抗炎作用[1-2]。龙葵果在全国均有分布，资源丰富，甾体生物碱含量高，具有潜在的开发价值。龙葵果主要含甾体生物碱、甾体皂苷、花色苷、多糖类等成分。其中甾体生物碱澳洲茄碱、澳洲茄边碱含量极高[3]。近些年以澳洲茄碱、澳洲茄边碱为活性成分的甾体生物碱相继开发成制剂进行临床研究。如澳大利亚学者ChamB.E.从魔鬼苹果（Solanumlinnaeanum）中制备得到甾体生物碱混合物BEC001，开发为乳膏剂CuradermBEC5用于治疗非黑色素瘤皮肤癌[4-5]。Solbec制药公司开发的产品coramsine/SBP002由1:1的澳洲茄碱和澳洲茄边碱组成，注射给药来治疗黑色素瘤和转移性肾细胞癌[6]。台湾德英生物科技股份有限公司从黄水茄（Solanumincanum）中得到水溶性萃取物，开发成凝胶制剂SR-T100治疗日光性角化病以及鳞状细胞原位癌[7]。大量文献也报道澳洲茄碱、澳洲茄边碱体内外显示很强的抗肿瘤活性，尤其对肝癌、乳腺癌、肺癌等有潜在的治疗作用[8-12]。但均未涉及对白血病的作用的相关报道。一些文献也报道了其中龙葵生物碱的提取方法和药理作用。CN200610041072揭示龙葵全草或果实，或黄果茄，或澳洲茄用50-90%乙醇提取，提取液浓缩至一定密度，加入酸性溶液，搅拌，过滤，滤液以弱极性或中等极性树脂吸附，（或者乙醇提取液浓缩后先加碱沉淀，沉淀加入酸性溶液溶解后以树脂吸附），先用碱洗或低浓度碱醇洗，再收集50-90%乙醇洗脱液，浓缩至无醇味，加入碱性溶液调pH8-10，静置，冷藏，搜集沉淀。沉淀干燥后，以有机溶剂溶解，硅胶柱层析，得到含量大于90.0%的澳洲茄边碱提取物。该提取物灌胃和腹腔注射给药对S180肉瘤、Hep肝癌移植性肿瘤小鼠有较强的抗肿瘤作用，同时澳洲茄边碱提取物还有一定的抗炎作用。CN200610041070揭示龙葵全草或果实，或黄果茄，或澳洲茄用50-90%乙醇提取，乙醇提取液浓缩至一定密度，加入酸性溶液，搅拌，过滤，滤液以弱极性或中等极性树脂吸附，（或者乙醇提取液浓缩后先加碱沉淀，沉淀加入酸性溶液溶解后以树脂吸附），先用碱洗或低浓度碱醇洗，再收集50-90%乙醇洗脱液，浓缩至无醇味，加入碱性溶液调pH8-10，静置，冷藏，搜集沉淀。沉淀干燥后，以有机溶剂溶解，硅胶柱层析，得到含量大于90.0%的澳洲茄碱提取物。该提取物灌胃和腹腔注射给药对S180肉瘤、Hep肝癌移植性肿瘤小鼠有较强的抗肿瘤作用，同时澳洲茄碱提取物还有一定的抗炎作用。CN200810033619揭示龙葵全草或果实用乙醇提取，提取物浓缩后用阳离子交换树脂层析，收集含碱乙醇洗脱部分，回收乙醇得浓缩液，离心分离得沉淀物，水和丙酮洗涤得龙葵提取物。该提取物含有活性成分澳洲茄碱、澳洲茄边碱和刺茄碱。该提取物在40mg/kg水平上皮下和腹腔给药可以明显降低小鼠肝癌H22、Lewis肺癌组织水平。在10、20mg/kg水平上可以明显降低正常小鼠和实验性糖尿病小鼠餐后血糖水平，降低哮喘豚鼠血清NO、T-NOS、iNOS水平，对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。CN200610041072、CN200610041070报道从龙葵全草或果实，或黄果茄，或澳洲茄中提取纯化层析得到高含量的澳洲茄碱/澳洲茄边碱。但硅胶柱层析成本高，产率低，环境污染大。CN200810033619报道龙葵全草或果实乙醇提取物经阳离子交换树脂得龙葵提取物，虽然方法简单，但产率低，仅为0.03%至0.15%。专利技术人用薄层扫描法测定生物碱含量，因龙葵中所含甾体生物碱和甾体皂苷成分在薄层上Rf值极为接近，薄层扫描法测定结果不准确，重复性差。虽然报道过有关龙葵全草或龙葵果实甾体生物碱的提取方法，但所得提取物产率低，重复性差，不适合工业生产。另外，所报道的生物碱提取物药理活性针对S180肉瘤、Hep肝癌和Lewis肺癌移植性肿瘤，未见对白血病的活性报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有制备方法中的不足，提供一种龙葵果总生物碱的制备方法，方法简单，所得总生物碱含量高，产率高，成本低，重现性好。并且对多种白血病细胞株有较强的抑制作用，有望应用到白血病领域。作为本专利技术的龙葵果总生物碱，其中包含澳洲茄碱、澳洲茄边碱和β2-澳洲茄边碱。基于所述组合物的总重量，所述澳洲茄碱、澳洲茄边碱和β2-澳洲茄边碱的含量之和为45-70%(w/w)，澳洲茄碱含量为10-20%(w/w)，澳洲茄边碱的含量为20-30%(w/w)，β2-澳洲茄边碱的含量为15-20%(w/w)。该方法具体如下：将龙葵的果实用甲醇、乙醇用回流、超声或渗漉法提取，提取次数为1至4次，提取溶剂的重量为龙葵果重量的6至30倍。将提取液浓缩得到浓缩液，将浓缩液用甲酸、乙酸、磷酸、硫酸、盐酸或硝酸1-20%(w/w)的溶液调pH值为1至3，并用石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或乙醚萃取，将萃取后的水溶液用中等极性或弱极性大孔树脂吸附，用17-25%(v/v)的甲醇或乙醇溶液洗脱，再以65-95%(v/v)的甲醇或乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，浓缩液用氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化镁调pH值为8至12，用乙酸乙酯、乙醚或正丁醇萃取，萃取液用水洗涤至中性，浓缩去除有机溶剂，干燥，得到龙葵果总生物碱提取物。根据本专利技术制备方法获得的总生物碱产率为0.6-1.2%(w/w)，澳洲茄碱、澳洲茄边碱和β2-澳洲茄边碱的含量之和为45-70%(w/w)。其中澳洲茄碱含量为10-20%(w/w)，澳洲茄边碱的含量为20-30%(w/w)，β2-澳洲茄边碱的含量为15-20%(w/w)，见附图1、2、3。本专利技术所述的龙葵果总生物碱可以用于制备预防与治疗白血病的药物。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：药材经醇提浓缩后用酸性溶液调pH值，增加用有机溶剂萃取这一步骤，该步骤能除去约12%(w/w)的非生物碱类杂质同时不损失目标成分。萃取后的水液澄清，不堵塞大孔树脂，便于大孔树脂重复使用。本专利技术仅用一次酸和碱，操作简便，所得总生物碱含量高，得率高，质量可控，重复性好，适合工业化大生产。附图说明附图1为澳洲茄碱；附图2为澳洲茄边碱附图3为β2-澳洲茄边碱；附图4为总生物碱检测图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明，但不以任何方式限制本专利技术。实施例1①龙葵果实3000g，加30倍量50%乙醇渗漉提取；②提取液浓缩至相对密度约1.05，加入20%的甲酸水溶液调pH值至3，用二氯甲烷萃取4次；③萃取后的酸水部位用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种龙葵果总生物碱提取物的制备方法，其特征在于按照以下的步骤进行：/n步骤1：将龙葵干燥近成熟果实用溶剂A提取，提取液浓缩，用酸液B调整pH值，然后用溶剂C进行萃取并分离出水层；/n步骤2：步骤1获得的水层用大孔树脂吸附，用溶剂D洗脱，然后再用溶剂E洗脱，收集溶剂E洗脱部分，浓缩，浓缩液用碱F调整pH值，然后用溶剂G萃取，萃取液用水洗涤至中性，浓缩干燥，得到该提取物。/n

【技术特征摘要】
1.一种龙葵果总生物碱提取物的制备方法，其特征在于按照以下的步骤进行：
步骤1：将龙葵干燥近成熟果实用溶剂A提取，提取液浓缩，用酸液B调整pH值，然后用溶剂C进行萃取并分离出水层；
步骤2：步骤1获得的水层用大孔树脂吸附，用溶剂D洗脱，然后再用溶剂E洗脱，收集溶剂E洗脱部分，浓缩，浓缩液用碱F调整pH值，然后用溶剂G萃取，萃取液用水洗涤至中性，浓缩干燥，得到该提取物。


2.如权利要求1所述方法，步骤1中：
溶剂A为甲醇或乙醇，优选为乙醇；
溶剂A浓度为50-90%(v/v)，优选为80%(v/v)；
酸液B为甲酸、乙酸、磷酸、硫酸、盐酸或硝酸的水溶液，优选盐酸；
酸液B的浓度为1-20%(w/v)，优选为10%(w/v)；
用酸液B调整后的pH值为1-3，优选为2；
溶剂C为石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或乙醚，优选为乙酸乙酯。


3.如权利要求1所述方法，步骤2中：
溶剂D为甲醇或乙醇，优选为乙醇；
溶剂D浓度为17-25%(v/v)，优选为20%(v/v)；
溶剂E为甲醇或乙醇，优选为乙醇；
溶剂E浓度为65-95%(v/v)，优选为75%(v/v)；
碱F为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化镁，优选为氢氧化钠；
用碱F调整后...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘锐，李茂，谢博君，孙传腾，范宸华，
申请(专利权)人：天津中新药业集团股份有限公司研究院分公司，
类型：发明
国别省市：天津;12