一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用，该聚丙烯酰胺微球主要由丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、N‑(3‑氨基丙基)甲基丙烯酰胺、过硫酸铵以及多聚赖氨酸构成，并经戊二醛进一步交联得到。本发明专利技术通过点样聚合和改进的反相微乳液聚合两种方法制备各种尺寸的聚丙烯酰胺微球，不仅具有可见荧光和近红外荧光、在强酸、强碱和高温等各种严苛条件下形态稳定，而且具有高正电荷，可用于有效捕获核酸分子如DNA。本发明专利技术同时提供一种使用聚丙烯酰胺微球从各种生物样品中快速提取DNA(3～5分钟)的新方法，吸附有DNA的聚丙烯酰胺微球可直接加入PCR反应，用于DNA分子的常规及定量PCR扩增检测。

A polyacrylamide microsphere for rapid extraction of nucleic acid and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用
本专利技术属于核酸提取及检测生物
，涉及一种基于聚丙烯酰胺微球的DNA快速提取及PCR检测新技术及其应用，具体涉及一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球及其制备方法和应用。
技术介绍
聚合酶链反应(PCR)扩增是进行DNA检测的有力工具，已广泛应用于基础生物学研究、医学诊断、法医学和农业科学等各个领域。在这些应用中，DNA提取对于PCR检测是不可避免的。但是，从样品中纯化DNA是一项复杂且限速的任务，需要训练有素的技术人员并涉及许多处理步骤。此外，还需要一些非常专业的材料(例如过滤管)和试剂(例如复杂的组分裂解液、结合液和洗涤液)。对于每天需要检测许多样本的临床技术人员而言，DNA纯化是一项繁琐的工作。因此，需要更简单和快速的DNA提取方法。最近的已经报道了基于不同类型的固体基质的快速核酸提取方法，这些固体基质包括纸、氧化铝膜、二氧化硅和纤维素。这些方法直接从固体基质中扩增核酸而无需单独的核酸洗脱步骤，从而简化了核酸提取过程。然而，尽管简化了提取过程，所有这些方法仍然需要相对复杂的制备或实验程序，例如加热，这限制了它们的实用性。最近，开发了一种使用未经处理的纤维素纸快速提取DNA的新方法，其中整个DNA提取可在不到30秒的时间内完成。可以将附着在纸上的DNA快速洗入PCR溶液中进行PCR检测。尽管这是一种无需设备的核酸提取试纸法，具有简单，快速且成本低廉的优点，但其低的DNA吸收和洗脱效率可能会挑战其广泛的应用。而且，除非使用多重PCR，否则一个DNA吸附条只能用于检测一个靶标。此外，该方法也无法改进为机器自动化进行。聚丙烯酰胺微球(PAMMP)由于其出色的生物相容性，易于控制的化学性质和物理性质而被广泛用于生物医学各领域。已有研究报道了基于PAMMP结合PCR扩增的单核苷酸多态性基因分型平台的构建。Shapero等将引物固定在制备的PAMMP上，通过PCR方法检测扩增的信号，实现高通量基因分型。此外，还合成了各种复合微球以用于不同用途。制备了具有双网状结构的聚丙烯酰胺/海藻酸钠复合微球，并测试了其对染料的吸收能力。聚丙烯酰胺/壳聚糖复合微球已用于消炎药的可控递送。功能改良的聚丙烯酰胺-接枝胶-karayapH敏感复合微球已用于实现结肠靶向药物的输送。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球，使用该聚丙烯酰胺微球可在短短数分钟内完成从各种生物样品中提取核酸如DNA，带有核酸的聚丙烯酰胺微球可直接加入PCR反应液，用于目标核酸分子的PCR扩增检测。本专利技术的聚丙烯酰胺微球具有可见及近红外荧光性能；具有大量正电荷；具有酸、碱及高温等严苛处理下的稳定性，同时可高效静电吸附核酸分子，如DNA分子。本专利技术还提供该用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球的制备方法和应用，重点还包括利用该聚丙烯酰胺微球提取快速提取核酸的方法。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述的一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球，所述聚丙烯酰胺微球主要由丙烯酰胺(AM)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APMA)、过硫酸铵(APS)以及多聚赖氨酸(ε-PL)构成，并经戊二醛(GTA)进一步交联得到。进一步地，所述聚丙烯酰胺微球具有可见及近红外荧光性能；具有大量正电荷；具有酸、碱及高温等严苛处理下的稳定性，同时可高效静电吸附核酸分子，如DNA分子。本专利技术所述的用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球的制备方法，包括如下步骤：聚丙烯酰胺微球经点样聚合法合成：将AM、MBA及APMA溶于去离子水中，获得均匀的丙烯酰胺单体溶液，将丙烯酰胺单体溶液、ε-PL和APS混合制备成混合液，将混合液点到附有聚乙烯的平皿上形成液滴，然后用含四甲基乙二胺(TEMED)的矿物油覆盖大量液滴，进行聚合形成聚丙烯酰胺微球；除去矿物油后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球并重悬于水中；在聚丙烯酰胺微球水溶液中加入戊二醛并孵育后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球除去过量的戊二醛，获得最终的可用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球。本专利技术所述的用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球的制备方法，包括如下步骤：聚丙烯酰胺微球经改进的反相微乳液聚合法合成：将Span80和己烷加入到容器中，将混合物在氮气吹送下搅拌直至表面活性剂Span80均匀分散，制成油相溶液；同时将丙烯酰胺、APMA和MBA溶解在去离子水中，以获得均匀的丙烯酰胺单体液体，然后将其与ε-PL和APS混合制备成水相溶液；将水相溶液加入到油相溶液中，然后将混合物在氮气吹送下搅拌；最后通过添加促进剂TEMED引发聚合反应，并将混合物充分搅拌，聚合形成聚丙烯酰胺微球；除去油相后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球并重悬于水中；在聚丙烯酰胺微球水溶液中加入戊二醛并孵育后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球除去过量的戊二醛，获得最终的可用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球。本专利技术中将ε-PL包含在聚丙烯酰胺微球中，ε-PL富含大量氨基，经戊二醛交联后不仅可与聚丙烯酰胺发生共价交联，而且产生大量的C＝N键，赋予聚丙烯酰胺微球终产品显著的可见及红外荧光性能；此外，ε-PL的加入可显著改善聚丙烯酰胺微球的生物相容性。进一步地，本专利技术中将APS直接加入水相溶液是本专利技术的主要创新；常规聚丙烯酰胺微球制备中，将APS加入油相，本专利技术发现这种方式下，形貌与荧光均匀稳定的聚丙烯酰胺微球。本专利技术通过将APS直接水相溶液，发现APS的加入不仅未显著影响乳浊液的形成，而且有利于形成形貌与荧光均匀稳定的聚丙烯酰胺微球。本专利技术所述的用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球在核酸快速提取中的应用。作为优选，所述核酸快速提取为使用裂解液裂解生物样品，之后将聚丙烯酰胺微球加入裂解物中，使核酸吸附在聚丙烯酰胺微球上，微球经洗涤液简单洗涤后，即可完成核酸的提取。其中，所述裂解液包括各种组分的裂解液，尤其是单一组分的各种浓度氢氧化钠溶液。作为优选，氢氧化钠溶液的浓度为0.4M。使用氢氧化钠溶液裂解各种生物样品，用于聚丙烯酰胺微球提取DNA，是本专利技术的最重要的创新之处。氢氧化钠溶液成分单一、环境友好、成本低廉。氢氧化钠溶液之所以可用于聚丙烯酰胺微球提取DNA方法中裂解样品，是因为如上所述本专利技术制备的聚丙烯酰胺微球在强酸及强碱条件下，性能非常稳定，不会发生解聚。此外，将聚丙烯酰胺微球直接加入氢氧化钠溶液裂解的样品裂解物中，并不影响核酸物质快速大量吸附到聚丙烯酰胺微球上。其中，所述洗涤液包括各种组分的洗涤液；作为优选，所述洗涤液是单一组分的洗涤液如水或乙醇溶液；作为优选，所述洗涤液是水。水作为洗涤液是一种环境最友好、成本最低廉的洗涤液。我们发现由于本专利技术制备的聚丙烯酰胺微球富含大量正电荷，核酸物质如DNA一旦与聚丙烯酰胺微球结合，即使使用水洗涤，DNA也不会从聚丙烯酰胺微球上被洗脱。其中，所述核酸吸附在聚丙烯酰胺微球上后可直接将带有核酸的聚丙烯酰胺微球加入常规PCR或定量PCR反应液中用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球，其特征在于，所述聚丙烯酰胺微球主要由丙烯酰胺(AM)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APMA)、过硫酸铵(APS)以及多聚赖氨酸(ε-PL)构成，并经戊二醛进一步交联得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球，其特征在于，所述聚丙烯酰胺微球主要由丙烯酰胺(AM)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APMA)、过硫酸铵(APS)以及多聚赖氨酸(ε-PL)构成，并经戊二醛进一步交联得到。


2.根据权利要求1所述的用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球，其特征在于，所述聚丙烯酰胺微球具有可见及近红外荧光性能；具有大量正电荷；具有酸、碱及高温等严苛处理下的稳定性，同时可高效静电吸附核酸分子。


3.一种权利要求1所述的用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
聚丙烯酰胺微球经点样聚合法合成：将AM、MBA及APMA溶于去离子水中，获得均匀的丙烯酰胺单体溶液，将丙烯酰胺单体溶液、ε-PL和APS混合制备成混合液，将混合液点到附有聚乙烯的平皿上形成液滴，然后用含四甲基乙二胺(TEMED)的矿物油覆盖液滴，进行聚合形成聚丙烯酰胺微球；除去矿物油后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球并重悬于水中；在聚丙烯酰胺微球水溶液中加入戊二醛并孵育后，用水洗涤聚丙烯酰胺微球除去过量的戊二醛，获得最终的可用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球。


4.一种权利要求1所述的用于核酸快速提取的聚丙烯酰胺微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
聚丙烯酰胺微球经改进的反相微乳液聚合法合成：将Span80和己烷加入到容器中，将混合物在氮气吹送下搅拌直至表面活性剂Span80均匀分散，制成油相溶液；同时将丙烯酰胺、APMA和MBA溶解在去离子水中，以获得均匀的丙烯酰胺单体液体，然后将其与ε-PL和APS混合制备成水相溶液；将水相溶液加入到油相溶液中，然后将混合物在氮气吹送下搅拌；最后通过添加促进剂TEMED引发聚合反应，并将混合物充分搅拌，聚合形成聚丙烯酰胺微球；除去油相后，用水洗涤聚丙烯酰胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，王军，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32