利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法技术

本发明专利技术公开了一种利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法，该方法通过在产酶培养基中加Cu

【技术实现步骤摘要】
利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法
本专利技术涉及环保
，具体涉及利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法。
技术介绍
漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一种含Cu2+多酚氧化酶(polyphenoloxidases，PPO)，其氧化底物包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素、生物色素、金属有机化合物等。漆酶按照来源可以分为3类，包括真菌漆酶、细菌漆酶和植物漆酶。目前细菌漆酶逐渐引起大家的关注，细菌漆酶往往不需要糖基化、热稳定性高、酶的最适pH范围广、在卤素溶液中稳定，对极端环境抗性高、细菌的生长周期短，繁殖力强等优势使其比真菌漆酶相比，具有更广阔的应用前景。有机磷农药是目前种类最多，运用最广泛的农药，可用作杀虫剂、除草剂。多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类。在弱酸性环境下能够稳定保存。低毒类的有敌百虫、乐果、氯硫磷、乙基稻丰散等，高毒类的有甲基对硫磷、二甲硫吸磷、敌敌畏、亚胺磷，剧毒类的有甲拌磷、内吸磷、对硫磷、保棉丰、氧化乐果。合理的农药的使用可以有利于农产品的保收和增产，但是农药的不合理使用会污染环境，不能及时分解的农药会进入到水、大气环境，甚至随着食物进入到人类体内，威胁人类的身体健康。农药制造厂的利用率低、回收率低等原因也使农药扩散到人类的居住环境，造成环境污染。随着大家安全意识的增强，蔬果、日用水的质量控制站在越来越重要的位置，如何用科学手段绿色环保安全地解决农药污染的问题，显得极其重要。目前降解农药的方法可以归纳为物理、化学、生物三类。物理方法包括吸附法、超声波法、洗涤法和辐照法；化学法包括氧化分解、水解法和光化学催化氧化法；生物法包括微生物酶解和微生物作用。目前有研究报道称淡紫青霉、粗毛栓菌真菌漆酶、木霉菌可以降解有机磷农药，然而目前关于细菌漆酶对有机磷农药的降解方面的研究鲜有报道，其应用条件等需要进一步研究。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法。本专利技术的目的采用如下技术方案实现：利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法，包括以下步骤：1)将产漆酶细菌接种到扩大培养基，培养至培养基呈浑浊状态；2)将步骤1)得到的扩大培养基加至产酶培养基中，培养，离心收集得到粗酶液；所述产酶培养基中含有Cu2+；3)将粗酶液加至农药稀释液，于pH＝8-10、温度为25-35℃、加入介体降解；所述介体为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、1-羟基本病三唑、紫尿酸或N-羟基乙酰苯胺。本专利技术研究了铜离子能有效活化产漆酶细菌、并在于pH＝8-10、温度为25-35℃时介体的作用下，可有效降解5种有机磷农药，包括乐果、敌敌畏、敌百虫、毒死蜱、氧化乐果，6h后的降解效率可高达15％以上。进一步地，步骤1)中，产漆酶细菌为Lrr3S菌株。进一步地，步骤1)中，所述扩大培养基包括以下组分：0.4-0.6％的酵母浸膏、0.8-1.2％的蛋白胨和0.4-0.6％的氯化钠，所述扩大培养基的pH为6.5-7.5。进一步地，步骤2)中，所述产酶培养基包括以下组分：0.4-0.6％的酵母浸膏、0.8-1.2％的蛋白胨、0.4-0.6％的氯化钠和0.001-0.005％的硫酸铜，所述产酶培养基的pH为6.5-7.5。进一步地，步骤2)中，扩大培养基与产酶培养基的体积比为1：2-4。进一步地，步骤2)中，采用3000-5000r/min离心10-30min。进一步地，步骤2)中，每1mL的粗酶液中加入0.5-1.5×10-3mmol的介体。进一步地，步骤3)中，所述介体为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐。进一步地，步骤3)中，加入浓度为0.002-0.003％硫酸铜。进一步地，步骤3)中，于pH＝9、温度为30℃时降解。尤其是pH值对降解的效率影响最大，当pH＝9时，降解效率显著高于其它pH＝8或pH＝10。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法，并研究了活化金属离子、最适宜pH、温度和介体，该降解方法可有效降解乐果、敌敌畏、敌百虫、毒死蜱、氧化乐果在内的有机磷农药，菌种的使用量小，6h的降解率可高于15％。附图说明图1为实施例2的无机磷含量与吸光值的标准曲线；图2为实施例2的5种有机磷农药的吸光值；图3为实施例3的温度对酶促农药降解的影响图；图4为实施例3的pH对酶促农药降解影响图；图5为实施例3的硫酸铜浓度对酶促农药降解影响图；图6为实施例5的介体对酶促农药降解影响作用；图7为实施例6的降解时间对酶促农药降解影响图。具体实施方式下面，结合附图和具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。以下是本专利技术具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。以下具体实施方式中，如未特殊说明，所记载的百分含量均为重量百分含量。以下具体实施方式中，Lrr3S菌种来源于仲恺农业工程学院，Lrr3S菌种分类命名为Brevibacteriumcasei，已于2019年12月04日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；电话：010-64807355；保藏号为No.19080。实施例1：产酶培养1)培养基制备：取酵母浸膏、蛋白胨和氯化钠加水配制成含有0.5％的酵母浸膏、1.0％的蛋白胨和0.5％的氯化钠，调节pH至7.0，得到扩大培养基；将五水硫酸铜溶于水，制成5％的硫酸铜溶液，向每L扩大培养基中加入8mL5％的硫酸铜溶液，调节pH至7.0，得到产酶培养基；扩大培养基和产酶培养基均用高压灭菌锅在121℃灭下灭菌20分钟。2)将Lrr3S菌株在超净工作台上将平板上的细菌接种到扩大培养基中，放在恒温培养箱中34℃培养1天；待培养液呈浑浊状态时，将其按1：3的体积比转移到产酶培养基中，在34℃恒温培养箱中培养6天；3)收集步骤2)获得的培养液，4000r/min离心20min，取上清液备用。4)使用愈创木酚法为底物测量漆酶酶活，在465nm波长处检测吸光值。实施例2：有机磷农药降解检测1)标准曲线绘制：使用磷酸二氢钾作为标准品，配制成无机磷标准溶液组，使用磷钼蓝分光光度法，在710nm处检测OD值，绘制标准曲线；结果如图1所示，磷含量与吸光值呈现较好的线性关系；2)农药中总磷含量测定：取0.5mL0.2％农药稀释液于50mL三角瓶中，加5mL过硫酸钾溶液，1mL1:35的硫酸溶液，加水至25mL，在调温电热套上加热至近干，把时间控制在30-40min内，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)将产漆酶细菌接种到扩大培养基，培养至培养基呈浑浊状态；/n2)将步骤1)得到的扩大培养基加至产酶培养基中，培养，离心收集得到粗酶液；所述产酶培养基中含有Cu

【技术特征摘要】
1.利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将产漆酶细菌接种到扩大培养基，培养至培养基呈浑浊状态；
2)将步骤1)得到的扩大培养基加至产酶培养基中，培养，离心收集得到粗酶液；所述产酶培养基中含有Cu2+；
3)将粗酶液加至农药稀释液，于pH＝8-10、温度为25-35℃、加入介体降解；所述介体为2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、1-羟基本病三唑、紫尿酸或N-羟基乙酰苯胺。


2.如权利要求1所述的利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法，其特征在于，步骤1)中，产漆酶细菌为Lrr3S菌株。


3.如权利要求1所述的利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法，其特征在于，步骤1)中，所述扩大培养基包括以下组分：0.4-0.6％的酵母浸膏、0.8-1.2％的蛋白胨和0.4-0.6％的氯化钠，所述扩大培养基的pH为6.5-7.5。


4.如权利要求1所述的利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法，其特征在于，步骤2)中，所述产酶培养基包括以下组分：0.4-0.6％的酵母浸膏、0.8-1.2％的蛋白胨、0.4...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘锐，张晓柔，陈欣强，赵翾，李南薇，刘功良，
申请(专利权)人：仲恺农业工程学院，
类型：发明
国别省市：广东;44