一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解N‑甲基有机氮农药中的应用，属于生物工程技术领域。其具体应用工艺包括：将Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶基因构建于pMA5‑trsox或pMA5‑YwbN‑trsox质粒，并转化Bacillus subtilis WB600细胞中进行胞内表达或分泌性表达，将转入pMA5‑trsox或pMA5‑YwbN‑trsox基因质粒的Bacillus subtilis WB600细胞进行发酵，获得的细胞及培养液上清与有机氮农药溶液混合进行生物降解。本发明专利技术具有较强生物安全性，生物降解活性高。

Application of a recombinant Bacillus subtilis cell in enzymatic biodegradation of N-methyl organic nitrogen pesticide

【技术实现步骤摘要】
一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药中的应用
本专利技术属于生物工程
，尤其是涉及一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药中的应用。
技术介绍
我国是世界上最大的农药使用国之一。有机氮农药和有机磷农药是使用最为广泛的两类农药。它们在使用过程中可以通过喷洒、挥发和风蚀作用进入大气以及水体，并在长时间内有一定的残留。其中，N-基有机氮农药是一类具有高效、低毒的广谱杀虫剂，且与有机磷农药相比具有较短的分解时间，因此我国农业生产和农药市场中到了广泛的使用。但是，N-甲基有机氮农药的残留不仅能对环境造成污染，，而且在进入恒温动物体内后能够对其生理过程产生重要的影响：如导致血浆中很多细胞的数量变化，改变肝脏坏死性和代谢能力，降低磷脂的合成和代谢，改变组织呼吸过程，抑制动物血液和某些组织胆碱酯酶，增加甲状腺活动，增加肾上腺重量，改变碱性磷酸酶、转氨酶、精氨酸酶等多种酶的活性等。此外，N-基有机氮农药的“三致”问题也受到国际社会的日益关注。N-甲基有机氮农药与有机磷农药相比，具有性质相对活泼，稳定性相对较弱，自然降解时间相对较短等特点，所以通常不被认是一种危险品。但是，全世界每年用于农业生产西维因超过了100000吨，其残留所造成的环境污染以及生态污染是必须面对的问题。目前，N-甲基有机氮农药的降解仅仅局限于自然降解，它们在使用过程中可以进入大气与水体，能够与OH、O3、NO3等自由基或分子发生反应，而其中OH自由基对N-甲基有机氮的降解起着非常重要的作用。但是，在N-甲基有机氮农药的酶法生物降解方面仍存在较大的空白。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药中的应用。本专利技术方法所用宿主菌BacillussubtilisWB600具有较好的生物安全性，反应条件温和，步骤简单，生物降解活性高。本专利技术的技术方案如下：一种重组BacillussubtilisWB600细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药中的应用，所述重组BacillussubtilisWB600细胞为转化带有pMA5-trsox基因质粒或pMA5-YwbN-trsox基因质粒的重组细胞。所述重组BacillussubtilisWB600细胞制备方法如下：将Thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶基因构建于pMA5-trsox质粒，并转化BacillussubtilisWB600细胞中，并进行胞内表达，得到重组BacillussubtilisWB600细胞；其中，所述pMA5-trsox质粒的基因序列如SEQIDNO.1所示。所述重组BacillussubtilisWB600细胞制备方法如下：将Thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶基因构建于MA5-YwbN-trsox质粒，并转化BacillussubtilisWB600细胞中，并进行内分泌表达，得到重组BacillussubtilisWB600细胞；其中，所述pMA5-YwbN-trsox质粒的基因序列如SEQIDNO.2所示。所述重组BacillussubtilisWB600细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药的具体方法步骤如下：将所得重组BacillussubtilisWB600细胞进行发酵培养，并与N-甲基有机氮农药溶液混合，进行生物降解。所述重组BacillussubtilisWB600细胞的酶法生物降解N-甲基有机氮农药的具体方法步骤如下：将所得重组BacillussubtilisWB600细胞进行发酵培养，得到培养液上清，并将所得培养液上清与N-甲基有机氮农药溶液混合，进行生物降解。所述重组BacillussubtilisWB600细胞发酵的方法为：使用TB培养基，在30-50℃下，发酵36-72h。所述生物降解的反应条件为：pH值为6-8，温度为30-50℃，时间为3-5h。所述重组BacillussubtilisWB600细胞或培养液上清与N-甲基有机氮农药溶液的体积用量比为1：1-1：50。所述N-甲基有机氮农药为西维因、速灭威、涕灭威、害扑威、残杀威、涕灭威、灭多威、异丙威、混杀威、牙根灵中一种或多种。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术利用培养BacillussubtilisWB600细胞，分别开展胞内或分泌性表达具有极端环境耐受性的Thermomicrobiumroseum来源肌氨酸氧化酶，能够高效的将N-甲基切除，使游离的氨基暴露，且更容易被细胞转入胞内并分解，从而加快N-甲基有机氮农药的生物降解。以N-甲基有机氮农药(西维因，速灭威，涕灭威以及害扑威)(100mM)为底物，在pH值为6-8，温度为30-50℃，反应时间为3-5h的温和条件下，快速降解N-甲基有机氮农药，降解率高于95％。附图说明图1为本专利技术pMA5-trsox质粒的构建，其中，TrSOX基因序列前端融合分泌表达信号肽YwbN序列，并通过NdeI与MluI两个限制性内切酶酶切位点链接如下pMA5质粒。图2为本专利技术pMA5-YwbN-trsox质粒的构建，其中，TrSOX基因序列前端融合分泌表达信号肽YwbN序列，并通过NdeI与MluI两个限制性内切酶酶切位点链接如下pMA5质粒。图3为本专利技术中涉及的常用N-甲基有机氮农药。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术进行具体描述。实施例1：一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药中的应用，其具体应用操作方法包括如下步骤：1)将转化入pMA5-trsox质粒(SEQIDNO.1)的BacillussubtilisWB600细胞以5％的接种量，接入5LTB培养基，温度30℃，搅拌桨转速150rpm，培养36h；同时，以转化入pMA5空质粒的BacillussubtilisWB600细胞作为空白对照。2)将上述500mL菌液离心清洗后重悬在500mL磷酸盐缓冲液内，分别与5L100mM含量的N-甲基有机氮农药西维因，速灭威，涕灭威以及害扑威混合，搅拌桨转速150rpm，pH值维持在7，反应温度维持在40℃，分别反应3h，4h以及5h，利用HPLC检测残留的N-甲基-有机氮农药含量(表1)。表1N-甲基有机氮农药降解率实施例2：一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药中的应用，其具体应用操作方法包括如下步骤：1)将转化入pMA5-trsox质粒(SEQIDNO.1)的BacillussubtilisWB600细胞以5％的接种量，接入5LTB培养基，温度30℃，搅拌桨转速150rpm，培养36h；同时，以转化入pMA5空质粒的BacillussubtilisWB600细胞作为空白对照。2)将上述500mL菌液离心清洗后重悬在500mL磷酸盐缓冲液内，分别与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组Bacillus subtilis WB600细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药中的应用，其特征在于，所述重组Bacillus subtilis WB600细胞为转化带有pMA5-trsox基因质粒或pMA5-YwbN-trsox基因质粒的重组细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组BacillussubtilisWB600细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药中的应用，其特征在于，所述重组BacillussubtilisWB600细胞为转化带有pMA5-trsox基因质粒或pMA5-YwbN-trsox基因质粒的重组细胞。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组BacillussubtilisWB600细胞制备方法如下：将Thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶基因构建于pMA5-trsox质粒，并转化BacillussubtilisWB600细胞中，并进行胞内表达，得到重组BacillussubtilisWB600细胞；其中，所述pMA5-trsox质粒的基因序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组BacillussubtilisWB600细胞制备方法如下：将Thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶基因构建于MA5-YwbN-trsox质粒，并转化BacillussubtilisWB600细胞中，并进行内分泌表达，得到重组BacillussubtilisWB600细胞；其中，所述pMA5-YwbN-trsox质粒的基因序列如SEQIDNO.2所示。


4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组Bacillussubt...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛瑜，张梁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32