本发明专利技术属于蛋白质和多肽药物技术领域，具体来说涉及一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，该制剂包括FGF21‑Fc融合蛋白，保护剂，缓冲剂，增溶剂；本发明专利技术还对该制剂的制备方法特别是冻干工艺进行优化，得到稳定的FGF21‑Fc融合蛋白冻干制剂。本发明专利技术制备的冻干制剂辅料少，进一步降低了临床用药的安全隐患，所得制剂外形饱满，质地均匀，复溶迅速，水分含量低于1％，稳定性好，方便储存和运输。
A lyophilized powder preparation of metabolic regulatory fusion protein
【技术实现步骤摘要】
一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂
本专利技术属于蛋白质和多肽药物
，具体涉及一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂。
技术介绍
成纤维细胞生长因子是在发育中的组织和成体组织中表达的多肽。存在超过20种成纤维细胞生长因子的整个家族(FGF家族)。FGF家族的三个成员(包括FGF19、FGF21和FGF23)构成了一个亚家族，起着充当内分泌因子参与代谢调节的作用。成纤维细胞生长因子21或FGF-21，分子量为19.5KDa，由181个氨基酸组成，且与鼠源FGF21有75％同源性。FGF21是细胞代谢的一种调节因子，在体内和体外展现多种有利的影响，比如抑制肝葡萄糖生成，刺激脂肪组织葡萄糖摄取，增加褐色脂肪组织产热，保护胰岛素质量和胰岛素水平且无促有丝分裂效应和其他副作用。FGF21可作为胰岛素和GLP-1类似物的替代物，是治疗II型糖尿病药物中极具前景的一种。长期的研究和临床实践表明FGF21和其他蛋白药物一样，存在稳定性差，储存期短等缺点，影响其治疗效果。专利CN107088224A公开了一种人FGF21冻干制剂，稳定性有所提高，制剂含水量较高，制剂在37℃下放置3个月，活性和纯度发生明显的变化，不能从根本上解决FGF21长期储存稳定性差的问题。天然FGF21很难被开发成临床治疗用生物制剂，主要原因包括：1、FGF21蛋白稳定性差，易受蛋白酶水解或酶促降解；2、天然FGF21构象非常不稳定，易发生聚集，低稳定性同时也增加了FGF21在大规模生产中的难度；3、天然FGF21半衰期非常短，人FGF21在小鼠体内半衰期只有0.5-1小时，在食蟹猴体内半衰期2-3小时。多种蛋白长效化技术被报道用于延长重组FGF21的体内半衰期。例如，专利WO2005091944，WO2006050247，WO2008121563、WO2012066075公开了FGF21与PEG分子链接，增加分子量，降低肾小球滤过率，延长体内滞留时间；WO2010084169和WO2012010553公开了FGF21与脂肪酸长链融合(能够结合血清蛋白)；WO2011071783、WO2011130417，WO2012158704，WO2012170438公开了能与FGFR/FGFR/β-klotho复合物特异性的结合的激动剂抗体模拟FGF21作用机制，来激活FGF/FGFR信号通路；WO2004110472，WO2005113606，WO2009149171等公开了通过与Fc片段融合来改善FGF半衰期。在蛋白药物长效化
，Fc融合技术运用最广泛，因为他具有更小的临床副作用(例如，不易诱发过敏反应或因半衰期延长而加剧药物的毒性作用)。开发FGF21-Fc长效融合蛋白药物关键在于以下几点：其一、能否保持FGF21的生物学活性。FGF21的C-末端含有β-Klotho的结合位点，因而Fc融合于FGF21C-末端会使其活性大幅降低，而融合在N-末端能最大程度地保留它与β-Klotho的结合亲和力。故现有技术中Fc片段大多融合与FGF21N-末端(Fc-FGF21)；其二，融合Fc后能显著改善FGF21的药动学特性，有效延长其半衰期以满足临床上每周两次甚至每周一次给药的用药需求；因FGF21的C-末端还含有蛋白酶水解位点，极易发生降解，其水解代谢物的体外活性下降近200倍。据Fc-FGF21药代动力学研究结果显示，其半衰期改善并不显著，这是因为融合蛋白中FGF21的C末端暴露，不能被Fc保护，因而易受蛋白酶攻击而发生降解。其三、如何降低接头序列或引入突变位点诱发免疫反应发生的风险；其四、融合Fc和/或引入突变位点是否可以改善FGF21的稳定性及其在高浓缩状态下的易聚合性。所以，理想的FGF21-Fc融合蛋白，一方面FGF21C-末端的抗蛋白酶水解能力增强，并且获得显著延长的半衰期；再一方面，FGF21C-末端与β-Klotho的结合亲和力不会因Fc的位阻效应而明显下降，导致其活性大幅度下降；同时，融合配体及连接肽的引入还不增加其免疫源性，且还能改善其稳定性。FGF21-Fc融合蛋白克服了野生型FGF21相关的生理学不稳定性的显著障碍。但重组人FGF21-Fc融合蛋白有容易聚集的倾向。对于重组人FGF21-Fc融合蛋白的制剂鲜有报道，因此，需要开发一种FGF21-Fc融合蛋白的制剂来满足临床用药需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种代谢调节融合蛋白的冻干制剂，该制剂配方简单，蛋白体系稳定，便于大规模生产、贮存和运输，临床给药方便。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种注射用重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂，包括重组FGF21-Fc融合蛋白、保护剂、增溶剂、缓冲剂。优选地，所述保护剂可选自糖、氨基酸、醇、盐类，进一步优选所述保护剂选自蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘氨酸、蛋氨酸和EDTA-二钠中的一种或几种；更加优选地，所述保护剂为甘露醇、蔗糖或海藻糖。优选地，所述的增溶剂为聚山梨酯20或聚山梨酯80，更加优选地，所述增溶剂为聚山梨酯80。优选地，所述的缓冲剂选自Tris/盐酸组氨酸缓冲体系或Tris/盐酸缓冲体系，所述缓冲体系的pH优选为7.5～8.5。在一个优选的实施方案中，一种注射用重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂，包括如下组分：FGF21-Fc融合蛋白20～50mg/ml保护剂50～300mM增溶剂0.02～0.06％(W/V)缓冲剂10～50mMpH7.5～8.5本专利技术所述药物组合物包含治疗有效量的重组人FGF21-Fc融合蛋白和选择适于给药方式的药学上或生理学上可接受的辅料。可接受的制剂材料优选在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性。本专利技术的处方筛选过程如下：缓冲体系的筛选：结合重组人FGF21-Fc融合蛋白分子特性，蛋白制剂工艺常用的缓冲体系进行筛选，制剂配方及检测结果分别见表1。将重组人FGF21-Fc融合蛋白溶解在缓冲体系中，逐渐升温测定蛋白溶液的熔化温度Tm值。结果见表2。表1、重组人FGF21-Fc融合蛋白制剂缓冲体系筛选表2、不同缓冲体系的重组人FGF21-Fc融合蛋白的Tm值结果Tm值表示蛋白热转变中点温度，对于多结构域蛋白可以有多个Tm值，它是蛋白质热稳定性的重要指标，上移代表了稳定性的增强，可以用来评估聚体的形成趋势。Tmonset是去折叠起始的温度。由表2结果可知，Tris/盐酸组氨酸和Tris/盐酸缓冲体系的Tm值较高，Tm值较高表明该缓冲体系下，FGF21-Fc融合蛋白比较稳定。因此我们选择Tris/盐酸或Tris/组氨酸作为本专利技术的缓冲体系。缓冲体系pH的筛选：我们将不同pH的Tris/盐酸作为缓冲体系，分别测定体系的Tm值。配方和测定结果分别见表3、表4。表3重组人FGF21本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，包括重组FGF21-Fc融合蛋白，保护剂，缓冲剂和增溶剂。/n
【技术特征摘要】
1.一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，包括重组FGF21-Fc融合蛋白，保护剂，缓冲剂和增溶剂。
2.根据权利要求1所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，所述的保护剂为甘露醇、蔗糖或海藻糖。
3.根据权利要求1所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，所述的缓冲剂为Tris/盐酸缓冲体系或Tris/盐酸组氨酸缓冲体系。
4.根据权利要求3所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，缓冲体系的pH为7.5～8.5，优选pH为8.0。
5.根据权利要求1所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，所述的增溶剂为聚山梨酯80。
6.根据权利要求1所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，包括如下组分：
FGF21-Fc融合蛋白
20～50mg/ml
保护剂
50～300mM
缓冲剂
10～50mM
增溶剂
0.02～0.06％(W/V)。
7.根据权利要求1所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，包括如下组分：
FGF21-Fc融合蛋白
20～50mg/ml
甘露醇或蔗糖
100～300mM
Tris/盐酸
20～50mM
聚山梨酯80
0.02％(W/V)。
8.一种权利要求1-7任一项所述制剂的冻干工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)冷冻控制：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白的西林瓶置于冻干机隔板上，5℃预冻，维持15～60min，再降温至-45～-40℃，维持2～6h进行冷冻；
(2)一次干燥：将隔板体系温度升温至-20～-15℃，维持40～50h，再升温至0～5℃，维持8～10h，完成一次干燥；
(3)解析干燥：将隔板体系温度升温至20～30℃，维持8～10h进行解析干燥，完成冻干工艺。
9.根据权利要求8所述的冻干工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)冷冻控制：将装入重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于隔板上设定温度5℃保持15～60min，然...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵丽丽，刘忠，
申请(专利权)人：鲁南制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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