多光子荧光显微成像系统及成像方法技术方案

本发明专利技术提供了一种多光子荧光显微成像系统，其包括可调谐飞秒激光器，以及沿所述可调谐飞秒激光器的激光输出光路依次布置的脉冲压缩器、扩束器、方向调节单元、光束转换单元、共振扫描振镜、聚焦单元，以及空间色散单元、聚光单元，和反射单元；还包括位于所述反射单元一侧的可搭载待测样品的样品台，位于所述样品台和所述反射单元之间的显微物镜，以及相对于所述样品台位于所述反射单元另一侧的图像采集单元，和分别与所述可调谐飞秒激光器、所述共振扫描振镜、所述图像采集单元相连的控制器。本发明专利技术也提供了基于以上成像系统的成像方法，且本发明专利技术的成像系统可时空聚焦结合进行实现快速成像，并能够提高分辨率以及有效抑制成像畸变。

Multiphoton fluorescence microscopic imaging system and imaging method

【技术实现步骤摘要】
多光子荧光显微成像系统及成像方法
本专利技术涉及荧光显微成像
，特别涉及一种新型时空聚焦的多光子荧光显微成像系统，同时本专利技术也涉及有基于该系统的多光子荧光显微成像方法。
技术介绍
荧光显微成像技术作为生物医学领域必不可少的观察手段已经得到广泛的应用和普遍的认可。目前，常用的荧光显微成像技术是单光子激光扫描共聚焦显微镜，其通过光聚焦的点激发并使用针孔滤除焦域以外的光信号对成像的影响，从而有效提高分辨率和信噪比。不过，单光子荧光显微成像所采用的光激发波长主要在可见光段范围(405nm-647nm)，生物样品对可见光波段吸收较高，光散射高从而限制单光子显微成像技术在生物成像，尤其是在深层、高分辨率成像领域的应用。相比单光子显微成像技术，多光子显微成像使用近红外波长光作为激发光源，可有效降低光毒性和光漂白等因素的影响，并可以更精确的穿透和定位深层荧光探针。但是，虽然多光子结合激光扫描共聚焦显微成像技术可以观测的更深，可由于生物组织折射率分布较复杂，成像畸变仍然是该类技术面临的重大难题。而且现有的激光扫描共聚焦显微技术普遍存在结构复杂、操作不便、成像速度慢以及分辨率低等问题，仍难以满足对生物组织等浑浊样品深层成像的需求。作为一种新的显微成像方式，时聚焦多光子荧光显微成像技术自本世纪被提出后，其已被证明可有效去除成像畸变，不过这种成像方法也存在需要单脉冲能量高的飞秒激光、仪器成本高，以及对样品的光损伤大，光照明不均匀和纵向分辨率低等问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种多光子荧光显微成像系统，以可实现快速成像，并能够提高分辨率以及有效抑制成像畸变。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种多光子荧光显微成像系统，其包括可调谐飞秒激光器，以及沿所述可调谐飞秒激光器的激光输出光路依次布置的脉冲压缩器、扩束器、改变所述激光线偏振方向的方向调节单元、将所述激光转换为一维平顶光束的光束转换单元、对转换后的一维平顶光束进行一维扫描的共振扫描振镜、对扫描后的光束进行一维聚焦以形成线型光束的聚焦单元，以及对所述线型光束进行频谱成分空间分离的空间色散单元、汇集空间分离的光束各频谱成分的聚光单元，和位于所述聚光单元之后的可反射汇集后光束的反射单元；且所述多光子荧光显微成像系统还包括位于所述反射单元一侧的可搭载待测样品的样品台，位于所述样品台和所述反射单元之间的显微物镜，以及相对于所述样品台位于所述反射单元另一侧的图像采集单元，和分别与所述可调谐飞秒激光器、所述共振扫描振镜、所述图像采集单元相连的控制器；其中，所述反射单元反射汇集后的光束以经所述显微物镜射向所述样品台，且所述反射单元亦设置为可透射所述样品台处出射的荧光，而供所述图像采集单元采集。进一步的，于所述可调谐飞秒激光器和所述脉冲压缩单元之间设有可通断所述激光输出的光阑单元。进一步的，所述光阑单元采用电控孔径光阑。进一步的，所述可调谐飞秒激光器输出的脉冲激光的中心波长在700-1000nm之间，重复频率80MHz、脉冲宽度150fs，且激光单脉冲能量为13-40nJ。进一步的，所述可调谐飞秒激光器输出激光光谱带宽在7nm-22nm范围内可调。进一步的，所述扩束器的放大倍数在8-10之间。进一步的，所述方向调节单元采用消色差半波片，并使得所述激光线偏振方向旋转90°。进一步的，所述光束转换单元采用相位板，所述相位板相位分布具有函数形式其中γ为相位调制深度，d为空间周期，为初始相位。进一步的，所述共振扫描振镜为一维扫描振镜，并沿正交于一维平顶光束的方向进行扫描。进一步的，所述聚焦单元采用柱透镜，且所述聚焦单元在与所述共振扫描振镜扫描方向平行的方向进行一维聚焦。进一步的，所述空间色散单元采用闪耀光栅。进一步的，所述聚光单元采用聚光透镜。进一步的，所述反射单元采用二向色镜。进一步的，所述图像采集单元采用相机，所述控制器采用预装有设定程序的计算机。进一步的，所述显微物镜采用平场消色差显微物镜。进一步的，在所述反射单元与所述图像采集单元之间设置有沿荧光出射方向依次布置的带通滤波片和镜筒透镜。进一步的，所述脉冲压缩器包括反射入射激光的第一反射镜，相对布置的供所述第一反射镜的反射激光依次经过的第一色散棱镜和第二色散棱镜，使所述第二色散棱镜出射激光经所述第二色散棱镜及所述第一色散棱镜返回的0°反射镜，以及反射所述第一色散棱镜的返回激光而形成输出激光的第二反射镜；所述第一色散棱镜与所述第二色散棱镜之间的间距可调，且所述0°反射镜设置为使经所述第一色散棱镜和所述第二色散棱镜来回的激光之间间距开。进一步的，所述显微物镜设置于升降平台上，以进行搭载于样品台上的待测样品的三维扫描。进一步的，在所述可调谐飞秒激光器与所述反射单元之间的激光输出光路上设有若干以改变光路方向的反射镜。进一步的，所述反射镜包括分置于所述光束转换单元两侧的反射镜a、反射镜b，位于所述共振扫描振镜与所述聚焦单元之间的反射镜c，以及位于所述空间色散单元和所述聚光单元之间的反射镜d。同时，本专利技术也提出有基于如上的多光子荧光显微成像系统的成像方法，且所述成像方法包括如下的步骤：s1、将所述空间色散单元换为反射镜，并将自相关仪置于所述显微物镜前；s2、开启所述可调谐飞秒激光器，并调整激光器使得自相关仪测量的脉冲激光宽度至设定阈值；s3、关闭所述可调谐飞秒激光器，将所述空间色散单元换回，并将自相关仪取走；s4、开启所述可调谐飞秒激光器，调整所述方向调节单元使激光线偏振方向旋转90°；s5、利用所述共振扫描振镜沿正交方向对激光进行一维扫描，并在与扫描平行的方向经所述聚焦单元对激光一维聚焦形成线型光束；s6、调整所述光束转换单元，并在所述空间色散单元前端或所述样品台处观测线型光束强度分布，直至形成均匀光强的平顶光束；s7、调整所述空间色散单元，使得激光经所述空间色散单元空间色散后的一级衍射效率满足设定阈值，且使激光经聚光单元汇集并被反射单元反射入显微物镜；s8、调整所述可调谐飞秒激光器的激光光谱带宽至设定阈值，使空间色散激光沿正交的x轴与y轴均完全填充显微物镜光瞳；s9、将待测样品放置于样品台上，利用来自显微物镜的激光激发样品产生荧光，打开图像采集单元进行荧光图像采集，并通过控制器生成采集图像。进一步的，所述成像方法还包括：s10、通过升降平台使显微物镜移动而利用图像采集单元三维扫描样品，并通过控制器生成三维图像。相对于现有技术，本专利技术具有以下优势：本专利技术通过可调谐飞秒激光器使得激光脉冲宽度可调，通过脉冲压缩器可控制脉冲宽度，利用光束转换单元可将激光器输出的基模高斯光束变换为一维平顶光束，通过共振扫描振镜扫描激光形成超快均匀照明，利用聚焦单元将激光束沿扫描方向聚焦成一维线型光束，以及通过空间色散单元将激光频谱成分空间色散，再经聚光单元汇集激光各频率成分并于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多光子荧光显微成像系统，其特征在于：/n所述多光子荧光显微成像系统包括可调谐飞秒激光器(1)，以及沿所述可调谐飞秒激光器(1)的激光输出光路依次布置的脉冲压缩器(3)、扩束器(4)、改变所述激光线偏振方向的方向调节单元(5)、将所述激光转换为一维平顶光束的光束转换单元(6)、对转换后的一维平顶光束进行一维扫描的共振扫描振镜(7)、对扫描后的光束进行一维聚焦以形成线型光束的聚焦单元(8)，以及对所述线型光束进行频谱成分空间分离的空间色散单元(9)、汇集空间分离的光束各频谱成分的聚光单元(10)，和位于所述聚光单元(10)之后的可反射汇集后光束的反射单元(11)；/n所述多光子荧光显微成像系统还包括位于所述反射单元(11)一侧的可搭载待测样品的样品台(13)，位于所述样品台(13)和所述反射单元(11)之间的显微物镜(12)，以及相对于所述样品台(13)位于所述反射单元另一侧的图像采集单元(16)，和分别与所述可调谐飞秒激光器(1)、所述共振扫描振镜(7)、所述图像采集单元(16)相连的控制器(17)；其中，所述反射单元(11)反射汇集后的光束以经所述显微物镜(12)射向所述样品台(13)，且所述反射单元(11)亦设置为可透射所述样品台(13)处出射的荧光，而供所述图像采集单元(16)采集。/n...

【技术特征摘要】
1.一种多光子荧光显微成像系统，其特征在于：
所述多光子荧光显微成像系统包括可调谐飞秒激光器(1)，以及沿所述可调谐飞秒激光器(1)的激光输出光路依次布置的脉冲压缩器(3)、扩束器(4)、改变所述激光线偏振方向的方向调节单元(5)、将所述激光转换为一维平顶光束的光束转换单元(6)、对转换后的一维平顶光束进行一维扫描的共振扫描振镜(7)、对扫描后的光束进行一维聚焦以形成线型光束的聚焦单元(8)，以及对所述线型光束进行频谱成分空间分离的空间色散单元(9)、汇集空间分离的光束各频谱成分的聚光单元(10)，和位于所述聚光单元(10)之后的可反射汇集后光束的反射单元(11)；
所述多光子荧光显微成像系统还包括位于所述反射单元(11)一侧的可搭载待测样品的样品台(13)，位于所述样品台(13)和所述反射单元(11)之间的显微物镜(12)，以及相对于所述样品台(13)位于所述反射单元另一侧的图像采集单元(16)，和分别与所述可调谐飞秒激光器(1)、所述共振扫描振镜(7)、所述图像采集单元(16)相连的控制器(17)；其中，所述反射单元(11)反射汇集后的光束以经所述显微物镜(12)射向所述样品台(13)，且所述反射单元(11)亦设置为可透射所述样品台(13)处出射的荧光，而供所述图像采集单元(16)采集。


2.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：于所述可调谐飞秒激光器(1)和所述脉冲压缩单元(3)之间设有可通断所述激光输出的光阑单元(2)。


3.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述光阑单元(2)采用电控孔径光阑。


4.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述可调谐飞秒激光器(1)输出的脉冲激光的中心波长在700-1000nm之间，重复频率80MHz、脉冲宽度150fs，且激光单脉冲能量为13-40nJ。


5.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述可调谐飞秒激光器(1)输出激光光谱带宽在7nm-22nm范围内可调。


6.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述扩束器(4)的放大倍数在8-10之间。


7.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述方向调节单元(5)采用消色差半波片，并使得所述激光线偏振方向旋转90°。


8.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述光束转换单元(6)采用相位板，所述相位板相位分布具有函数形式其中，γ为相位调制深度，d为空间周期，为初始相位。


9.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述共振扫描振镜(7)为一维扫描振镜，并沿正交于一维平顶光束的方向进行扫描。


10.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述聚焦单元(8)采用柱透镜，且所述聚焦单元(8)在与所述共振扫描振镜(7)扫描方向平行的方向进行一维聚焦。


11.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述空间色散单元(9)采用闪耀光栅。


12.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述聚光单元(10)采用聚光透镜。


13.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述反射单元(11)采用二向色镜。


14.根据权利要求1所述的多光子荧光显微成像系统，其特征在于：所述图像采集单元(16)采用相机，所述控制...

【专利技术属性】
技术研发人员：温维佳，娄凯，
申请(专利权)人：温维佳，
类型：发明
国别省市：重庆;50