一种应用于无创产前检测的参考物质及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种应用于无创产前检测的参考物质及其制备方法，属于临床检验学和生物技术领域。一种用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，用DNA片段化因子酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核，得到模拟母亲cfDNA(核酸短片段)组分。本发明专利技术得到的含有不同染色体非整倍体cfDNA片段与含正常染色体数目cfDNA片段混合制作的无创产前检测参考物质，提供了一种可用于制造室内质量控制和室间质量评价的参考物质的方法。这种利用不同酶消化产生的含不同染色体非整倍体cfDNA片段与含正常染色体数目cfDNA混合制作参考物质的方法在国内外尚属首例。这种方法也能用于制作一系列的用于其他无创检测的混合cfDNA样本参考物质。

A reference material for noninvasive prenatal testing and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种应用于无创产前检测的参考物质及其制备方法
本专利技术公开了一种应用于无创产前检测的参考物质及其制备方法，属于临床检验学和生物

技术介绍
胎儿染色体非整倍体主要是由染色体数目或结构异常所引起的疾病，临床上主要以21-三体(唐氏综合症)、18-三体(爱德华氏综合征)、13-三体(帕陶氏综合征)最常见和最易出现，患儿通常表现为智力障碍、发育迟缓或成年后生育障碍等，该类疾病的发病率随着孕妇年龄的增高而增高，且目前尚无有效的治疗方法。因此广泛开展染色体疾病的产前筛查和产前诊断，对于降低出生缺陷、实现优生优育和提高人口质量具有重要意义。现有的产前诊断技术包括侵入性检测方法和无创检测方法，前者如羊膜穿刺或绒毛膜取样获取胎儿组织，进行染色体核型分析，但缺点是均为有创性，具有引起流产等风险；国内外广泛采用的传统无创检测方法包括孕妇血清生化标志物筛查和超声检查，但该类手段准确率较低，检测结果的假阳性率和假阴性率都较高，同时大量的假阳性给孕妇及其家庭也带来巨大焦虑，可能引起后代神经发育和精神异常。1997年，卢煜明教授发现在孕妇血浆中含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，其特征在于：用DNA片段化因子(DNA fragmentation factor，DFF)酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核，得到模拟母亲cfDNA(核酸短片段)组分。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，其特征在于：用DNA片段化因子(DNAfragmentationfactor，DFF)酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核，得到模拟母亲cfDNA(核酸短片段)组分。


2.根据权利要求1所述的用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，其特征在于：所述模拟母亲样本细胞系为正常染色体数目的人细胞系。


3.根据权利要求1所述的用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，其特征在于：所述人细胞系为永生化细胞系。


4.根据权利要求1至3中任何一项所述的用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，其特征在于，所述酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核的方法是：
(1)取模拟母亲样本细胞系的细胞核约1×107个，用1ml缓冲液A洗涤细胞核，重复洗涤2次，200g4℃离心5min，弃去上清后，用100μl缓冲液A重悬细胞核，得到细胞核溶液；
缓冲液A的组分为20mMHepes-KOH(pH7.5)，10mMKCl，1.5mMMgCl2，1mMEDTA钠，1mMEGTA钠，1mMDTT，0.1mMPMSF；
(2)配制消化反应体系，于37℃孵育2小时；
消化反应体系为：浓度为0.585mg/ml的DFF溶液30μL，浓度为95ng/μL的人caspase-3(细胞凋亡蛋白酶-3)45μL，缓冲液A28μL，步骤(1)得到的细胞核溶液10μL；
(3)加入25ul反应终止液终止反应，颠倒混匀，50℃孵育1h；终止液的组成为0.6％SDS，50mMEDTA，6mg/ml蛋白酶K；
(4)测定反应产物中DNA浓度，毛细管电泳观察核酸片段大小分布。


5.权利要求1至4中任何一种方法制备得到的用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分，模拟母亲cfDNA的长度为160bp左右，与临床孕妇血浆中的母亲cfDNA的长度160-170bp接近。


6.一种无创产前检测的参考物质的制备方法，其特征在于：用微球菌核酸酶(Micrococcalnuclease，MNase)酶切模拟胎儿样本细胞系的细胞核，得到模拟胎儿cfDNA组分；用DNA片段化因子(DNAfragmentationfactor，DFF)酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核，得到模拟母亲cfDNA组分；将模拟胎儿cfDNA组分与模拟母亲cfDNA组分按质量比为1∶99～30∶70混合，得到模拟混合cfDNA组分；将模拟混合cfDNA组分加入到人造血浆中，制成模拟混合cfDNA浓度为1-100ng/ml的参考物质。


7.根据权利要求6所述的无创产前检测的参考物质的制备方法，其特征在于：所述模拟母亲样本细胞系为正常染色体数目的人细胞系，所述模拟胎儿样本细胞系为染色体非整倍体阳性人细胞系或正常染色体数目的人细胞系。


8.根据权利要求6所述的无创产前检测的参考物质的制备方法，其特征在于：所述人细胞系为永生化细胞系，所述人造血浆是含有浓度为5％的人血浆白蛋白的模拟体液。


9.根据权利要求6至8中任何一项所述的无创产前检测的参考物质的制备方法，其特征在于：
所述用微球菌核酸酶酶切模拟胎儿样本细胞系的细胞核的方法如下，
(1)取模拟胎儿样本细胞系的细胞核1×107个，用2-3mlMNase反应缓冲液洗涤细胞核，重复洗涤3次，120g4℃离心10min，弃去上清后，用100μlMNase反应缓冲液重悬细胞核，得到细胞核悬液；
MNase反应缓冲液成分为1×Mic...

【专利技术属性】
技术研发人员：李金明，丁健生，张瑞，
申请(专利权)人：北京医院，
类型：发明
国别省市：北京;11