一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术属于生物分析检测技术领域，尤其涉及一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法、试剂盒及其应用。本发明专利技术设计了有两条轨道的双链脱氧核糖核酸。轨道1以5’‑FAM和3’‑BHQ‑1为荧光探针，在5’‑FAM末端有2‑nt的突出结构。轨道2是一个带有5’‑PO4的ssDNA，该序列的大部分与探针互补，在5’‑PO4末端有0‑10nt的突出结构。没有碱性磷酸酶时，λexo选择与5’‑PO4末端结合并消化互补链，导致低荧光信号。当样品中有碱性磷酸酶时，轨道2中的5’‑PO4被转化为5’‑羟基；λexo选择与5’‑FAM末端结合并消化探针以离开FAM和BHQ‑1并发出强荧光信号。

A method, kit and application of alkaline phosphatase determination based on path selector with alkaline phosphatase as switch

【技术实现步骤摘要】
一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法、试剂盒及其应用
本专利技术属于生物分析检测
，尤其涉及一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
碱性磷酸酶是一种催化去磷酸化反应的酶。它广泛存在于肝、肠、肾、骨和胎盘等多种组织中。碱性磷酸酶的异常水平被证明与多种疾病高度相关，包括骨相关疾病、肝功能障碍、前列腺癌、乳腺癌和糖尿病。迄今为止，已经开发了许多方法来定量碱性磷酸酶的酶活性，如比色法、表面增强拉曼散射法、色谱法、电化学法。然而，这些具有自身特点的方法不可避免地受到一些限制，例如灵敏度差、设计复杂和耗时过长。近年来，由于荧光分析具有灵敏度高、方便、仪器易得等特点，越来越多的人致力于研究碱性磷酸酶的荧光分析方法。然而，有些荧光分析方法的检出限仍不够令人满意，从1U/L到19U/L不等。一些研究人员开发了新的荧光分析方法，具有更好的效果。一类是利用量子点表面配体被碱性磷酸酶消化后发出荧光。检出限为0.0018U/L至0.07U/L。然而，量子点需要复杂的制备过程，不容易用于实际应用。另一类策略是使用磷酸基团标记的DNA来构建荧光传感器。碱性磷酸酶消化后，基团转化为羟基，引发下游反应。检测限范围从0.0002U/L到0.02U/L。然而，现有的方法都需要精心的实验设计和较长的检测时间。因此，临床应用迫切需要一种灵敏度高、设计简单、快速的碱性磷酸酶检测方法。核酸外切酶(λexo)是一种具有5’->3’切割活性的核酸外切酶。它对具有或不具有5’磷酸基团的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)底物具有选择性。因此，λexo在一些工作中被用于碱性磷酸酶检测。然而，λexo对5’-PO4和5’-OH的选择性是有限的，即使在复杂的信号放大设计中，这些方法的LOD也只有0.01U/L至40U/L。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法、试剂盒及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术提供的该方法利用λexo对于不同5’末端(5’-PO4和5’-OH)具有不同亲和性，通过引入5’-FAM结构，结合碱性磷酸酶的去磷酸化的开关作用，构建了一种新的路径选择器来高灵敏度、简单、快速地检测碱性磷酸酶的活性本专利技术是这样实现的，一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法，其特征在于，包括：将去离子水、CutSmart缓冲液、λexo缓冲液、含有荧光基团及猝灭基团的探针序列、含有5’-PO4的探针序列的互补链混合；将混合液经85℃下升温和55℃下退火，冷却；待冷却到37℃，加入λexo和待测样品，进行酶切反应，进行荧光检测。进一步地，所述荧光基团为FAM荧光基团、HEX荧光基团或VIC荧光基团中的任一种。所述荧光探针序列为FAM-TCTCCACAGACACATAC-BHQ。进一步地，所述FAM荧光基团的5’-FAM末端有2-nt的突出结构。进一步地，所述猝灭基团为BHQ-1猝灭基团、BHQ-2猝灭基团和BHQ-3猝灭基团中的任一种。进一步地，所述互补链与探针序列互补，且在5’-PO4末端有0-10nt的突出结构。进一步地，所述互补链与探针序列互补，且在5’-PO4末端有7nt的突出结构；所述序列为PO4-GATCGCCGTATGTGTCTGTGGACCCGAGAGTAAG。进一步地，去离子水的用量为35μL；CutSmart缓冲液的用量为2.5μL；λexo缓冲液的用量为2.5μL；探针序列的用量为5μmol/L5μL；互补链的用量为5μmol/L5μL；在85℃下升温和55℃下退火，待冷却到37℃后，加入2μL的20U/L的λexo，1μL待测样品。进一步地，借助酶标仪进行荧光检测，荧光强度30秒记录一次，记录20分钟，增益水平为60；激发波长和吸收波长分别设置为485nm和582nm。进一步地，可以采用其他的荧光基团例如HEX，VIC，也可以用其他的淬灭基团BHQ-2，BHQ-3。本专利技术中仅以FAM荧光基团和BHQ-1猝灭基团为例进行详细说明。如上述的一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法在碱性磷酸酶测定中的应用。一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定试剂盒，包括：CutSmart缓冲液，λexo缓冲液、含有荧光基团及猝灭基团的探针序列、含有5’-PO4的探针序列的互补链，λexo；利用所述试剂盒对碱性磷酸酶进行测定的方法同权利要求1-7任一所述。如上述的一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定试剂盒在碱性磷酸酶测定中的应用。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术设计了一种以碱性磷酸酶为开关的基于路径选择的智能生物传感器(PCBSB)来检测碱性磷酸酶的活性。这是第一个以DNA为轨道，以酶为开关的路径选择器。该检测方法灵敏度高(0.014U/L)，选择性高，设计简单，读出速度快(20分钟)。与传统设计不同，在PCBSB中，λexo有两条路径可供选择。路径选择特性是基于λexo的新性质实现的。常规认知中，λexo被认为仅消化具有5’-PO4的底物。然而，本申请的专利技术人研究发现，λexo消化突出2个末端的5’-FAM结构效率更高，并且对于该突出的2个碱基类型没有具体限制。同时λexo对不同的5’末端具有不同的活性，有5’-PO4>5’-FAM>5’-OH的关系。本专利技术基于该发现设计了一个有两条轨道的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)。轨道1是单链脱氧核糖核酸(ssDNA)，以5’-FAM和3’-BHQ-1为荧光探针。轨道2是一个带有5’-PO4的ssDNA，该序列的大部分与探针互补。在5’-FAM末端有2-nt的突出结构，在5’-PO4末端有0-10nt的突出结构。本专利技术所构建的路径选择器中，探针中的5’-FAM被3’-BHQ-1(猝灭，初始荧光信号非常低。λexo充当轨道消化机器来消化其中一个轨道。碱性磷酸酶充当控制λexo路径选择的开关。样品中没有碱性磷酸酶时，由于λexo的切割偏好，λexo倾向于选择与5’-PO4末端结合并消化互补链。在这种情况下，λexo走在轨道1上，消化轨道2。本专利技术中将此反应命名为路径A，这将导致低荧光信号，因为轨道1(探针)是完整的。当样品中有碱性磷酸酶时，轨道2中的5’-PO4转化为5’-羟基。然后λexo倾向于选择与5’-FAM末端结合并消化探针以离开FAM和BHQ-1并发出强荧光信号。在这种情况下，λexo走在轨道2上，消化轨道1。本专利技术中将这一反应命名为路径B。随着PACSB中碱性磷酸酶活性的增加，更多λexo将选择路径B并发出更多荧光信号。因此，荧光增加的速率与碱性磷酸酶的活性有关且与碱性磷酸酶浓度之间呈良好的线性关系。附图说明图1是本专利技术的设计原理示意图；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法，其特征在于，包括：/n将去离子水、CutSmart缓冲液、λexo缓冲液、含有荧光基团及猝灭基团的探针序列、含有5’-PO4的探针序列的互补链混合；/n将混合液经85℃下升温和55℃下退火，冷却；/n待冷却到37℃，加入λexo和待测样品，进行酶切反应，进行荧光检测；/n所述荧光基团的5’末端有2-nt的突出结构。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法，其特征在于，包括：
将去离子水、CutSmart缓冲液、λexo缓冲液、含有荧光基团及猝灭基团的探针序列、含有5’-PO4的探针序列的互补链混合；
将混合液经85℃下升温和55℃下退火，冷却；
待冷却到37℃，加入λexo和待测样品，进行酶切反应，进行荧光检测；
所述荧光基团的5’末端有2-nt的突出结构。


2.根据权利要求1所述的一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法，其特征在于：所述荧光基团为FAM荧光基团、HEX荧光基团或VIC荧光基团中的任一种。


3.根据权利要求1所述的一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法，其特征在于：所述猝灭基团为BHQ-1猝灭基团、BHQ-2猝灭基团和BHQ-3猝灭基团中的任一种。


4.根据权利要求1所述的一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法，其特征在于：所述互补链与探针序列互补，且在5’-PO4末端有0-10-nt的突出结构。


5.根据权利要求4所述的一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法，其特征在于：所述互补链与探针序列互补，且在5’-PO4末端有7-nt的突出结构。

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【专利技术属性】
技术研发人员：吴曈勃，肖先金，张家瑞，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42