一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法制备甘油单酯型n‑3 PUFA的方法，属于酶的分离与应用技术领域。首先采用甘油三酯脂肪酶催化富含n‑3 PUFA的油脂制备甘油单酯，随后采用甘油单酯脂肪酶选择性催化甘油单酯适度水解制备甘油单酯型n‑3 PUFA，反应结束后，离心分离上层油相，分子蒸馏纯化后，收集馏出物即为甘油单酯型n‑3 PUFA。该方法操作简单、反应时间短、速率快，产物的含量和回收率均较高，且反应过程中酶和有机溶剂均可反复利用，节能环保，经济效益高。

An enzymatic method for the preparation of n-3PUFA

【技术实现步骤摘要】
一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法
本专利技术属于酶的分离与应用
，具体涉及一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法。
技术介绍
流行病学和临床研究表明，n-3PUFA(n-3Polyunsaturatedfattyacids)如EPA、DPA和DHA等在人体健康中起着重要作用。研究表明，EPA和DHA可降低患冠心病的风险并有助于大脑、神经和视网膜的发育。通常，n-3PUFA主要以游离脂肪酸、脂肪酸乙酯、甘油三酯和磷脂等形式存在。研究表明，相比于游离脂肪酸型、甘油三酯型和脂肪酸乙酯型，n-3PUFA以甘油单酯型存在时具有更高的生物利用度。作为n-3PUFA的良好载体，长期以来，甘油单酯型n-3PUFA的制备一直是研究的热点。由于n-3PUFA高温易发生氧化和异构化，因此，通常采用反应条件温和、催化特异性高和环保的生物酶法制备甘油单酯型n-3PUFA。目前，酶法甘油解和酶法醇解常被用来制备甘油单酯型n-3PUFA。Solaesa等(FoodChem.,2016,190:960-967)采用酶法甘油解制备甘油单酯型n-3PUFA，产物中甘油单酯含量和回收率均高于90％，但产物单甘酯中n-3PUFA含量低于30％；He等(BioresourceTechnol.,2016,219:466-478；BioresourceTechnol.,2017,224:445-456；FoodChem.,2017,219:230-239)采用酶法醇解制备甘油单酯型n-3PUFA，反应48h后，产物单甘酯中n-3PUFA含量高于90％，但n-3PUFA回收率仅为40％。总体而言，现有酶法制备甘油单酯型n-3PUFA时难以同时制备得到高n-3PUFA含量和高n-3PUFA回收率的甘油单酯型n-3PUFA。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法，操作简单、反应时间短、速率快，产物的含量和回收率均较高。本专利技术是通过以下技术方案来实现：一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法，包括以下步骤：步骤1：在有机溶剂中，采用固定化甘油三酯脂肪酶催化含n-3PUFA的油脂进行甘油解反应，反应结束后，回收有机溶剂并离心收集上层油相；步骤2：向步骤1得到的上层油相中加入缓冲液和甘油单酯脂肪酶选择性催化甘油单酯进行适度水解反应，反应结束后，离心收集上层油相；步骤3：将步骤2得到的上层油相进行分子蒸馏纯化，收集馏出物，得到甘油单酯型n-3PUFA。优选地，步骤1中，固定化甘油三酯脂肪酶为Novozym435或Lipozyme435。优选地，步骤1中，有机溶剂为叔丁醇或叔戊醇。优选地，步骤1中，固定化甘油三酯脂肪酶的添加量为底物油总质量的5～10％，甘油与含n-3PUFA的油脂的摩尔比为5:1，有机溶剂的添加量为底物总质量的2～3倍量mL/g。优选地，步骤1中的反应，是在40～60℃的反应温度、300～500rpm的搅拌速度下反应2～6h。优选地，步骤2中，甘油单酯脂肪酶为MGLPII，甘油单酯脂肪酶的用量为200～300U/g底物质量。优选地，步骤2中，缓冲液为pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液，缓冲液加入量为步骤1得到的上层油相质量的30～100wt％。优选地，步骤2中，反应温度为40～60℃，反应时间为0.5～2h。优选地，步骤3中，分子蒸馏纯化的反应条件为：进料温度60℃，进料速度1～2mL/min，冷凝温度35～40℃，一级蒸发面温度110℃，二级蒸发面温度160℃，刮膜电机转速250～270rpm。优选地，步骤3中，一级分子蒸馏的操作压强≤20Pa，二级分子蒸馏的操作压强≤5Pa。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术公开的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法，首先采用甘油三酯脂肪酶催化富含n-3PUFA的油脂制备甘油单酯，随后采用甘油单酯脂肪酶选择性催化甘油单酯适度水解制备甘油单酯型n-3PUFA，反应结束后，离心分离上层油相，分子蒸馏纯化后，收集馏出物即为甘油单酯型n-3PUFA。甘油单酯脂肪酶MGLPII催化不同碳链长甘油单酯发生水解反应时，对中碳链(C8-C12)甘油单酯和长碳链(C14-C18)甘油单酯具有较高的活性，而对EPA、DPA和DHA这类超长碳链的n-3PUFA的特异性却较差，因而将其应用于水解富含n-3PUFA的甘油单酯时，通过控制适度水解可将n-3PUFA富集于甘油单酯中。该方法操作简单、反应时间短、速率快，产物的含量和回收率均较高，且反应过程中的酶和有机溶剂均可反复利用，节能环保，经济效益高。进一步地，固定化甘油三酯脂肪酶采用Novozym435或Lipozyme435，可更高效地催化含n-3PUFA的油脂转化生成甘油单酯。进一步地，有机溶剂采用叔丁醇或叔戊醇，可有效促进底物含n-3PUFA的油脂和甘油充分混合，且可保持固定化甘油三酯脂肪酶具有较高的操作稳定性。进一步地，固定化甘油三酯脂肪酶的添加量为底物油总质量的5％～10wt％，甘油与含n-3PUFA的油脂的摩尔比为5:1，有机溶剂的添加量为底物总质量的2～3倍量mL/g，可有效确保底物充分混匀，在保证较高反应速率的前提下尽可能降低制备成本。进一步地，步骤1是在40～60℃的反应温度、300～500rpm的搅拌速度下反应2～6h，可高效促进含n-3PUFA的油脂转化生成甘油单酯，且可有效避免n-3PUFA氧化。进一步地，甘油单酯脂肪酶采用MGLPII，甘油单酯脂肪酶的用量为200～300U/g底物质量，可特异性催化中、长链甘油单酯水解，确保产物单甘酯中n-3PUFA含量和回收率高，且可在保证较高反应速率的前提下尽可能降低制备成本。进一步地，缓冲液采用pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液，缓冲液加入量为步骤1得到的上层油相质量的30％～100wt％，可更有效促进中、长链甘油单酯特异性水解。进一步地，步骤2的反应温度为40～60℃，反应时间为0.5～2h，可高效促进中、长链甘油单酯特异性水解，且可有效避免n-3PUFA氧化。进一步地，步骤3的参数，可确保甘油单酯型n-3PUFA的较高回收率。进一步地，一级分子蒸馏的操作压强≤20Pa，二级分子蒸馏的操作压强≤5Pa，可有效避免n-3PUFA氧化。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。含有n-3PUFA的油脂一般为海洋鱼油、藻油或其混合物。实施例1准确称取100g鳀鱼油和50g甘油置于1L具塞锥形瓶中，加入250mL叔丁醇，并震荡混匀；将上述锥形瓶置于50℃的恒温气浴摇床中，转速设置为300rpm；加入5gNovozym435后反应开始计时；反应6h后，过滤回收Novozym435，减压蒸馏回收叔丁醇，随后离心收集上层油相；液相色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1：在有机溶剂中，采用固定化甘油三酯脂肪酶催化含n-3PUFA的油脂进行甘油解反应，反应结束后，回收有机溶剂并离心收集上层油相；/n步骤2：向步骤1得到的上层油相中加入缓冲液和甘油单酯脂肪酶选择性催化甘油单酯进行适度水解反应，反应结束后，离心收集上层油相；/n步骤3：将步骤2得到的上层油相进行分子蒸馏纯化，收集馏出物，得到甘油单酯型n-3PUFA。/n

【技术特征摘要】
1.一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：在有机溶剂中，采用固定化甘油三酯脂肪酶催化含n-3PUFA的油脂进行甘油解反应，反应结束后，回收有机溶剂并离心收集上层油相；
步骤2：向步骤1得到的上层油相中加入缓冲液和甘油单酯脂肪酶选择性催化甘油单酯进行适度水解反应，反应结束后，离心收集上层油相；
步骤3：将步骤2得到的上层油相进行分子蒸馏纯化，收集馏出物，得到甘油单酯型n-3PUFA。


2.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法，其特征在于，步骤1中，固定化甘油三酯脂肪酶为Novozym435或Lipozyme435。


3.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法，其特征在于，步骤1中，有机溶剂为叔丁醇或叔戊醇。


4.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法，其特征在于，步骤1中，固定化甘油三酯脂肪酶的添加量为底物油总质量的5～10％，甘油与含n-3PUFA的油脂的摩尔比为5:1，有机溶剂的添加量为底物总质量的2～3倍量mL/g。


5.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李道明，刘看看，刘宁，崔俊杰，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61