靶标双链核酸杂交期间的错误检测制造技术

执行一系列杂交以从初始片段形成靶标双链核酸，其中每个另外的杂交步骤使成对的较早杂交步骤的直接产物杂交。对于至少一个另外的杂交步骤H

Error detection during target DSN hybridization

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶标双链核酸杂交期间的错误检测本专利技术的技术涉及使核酸片段杂交以形成靶标双链核酸，例如在DNA或其他双链核酸的人工合成领域中。对双链核酸(诸如DNA、RNA或XNA)的人工合成或合成性(synthetic)合成的需求不断增长。通过使得能够在工厂或实验室中从头合成双链核酸的靶标序列，而不是例如依靠基于克隆的技术复制现有双链核酸的部分，产生双链核酸的靶标序列的成本可大大降低，并且可以提高可生成序列的速度。通常，可以通过例如使用化学手段(例如亚磷酰胺偶联化学)和/或酶促手段(例如经修饰的末端脱氧核苷酸转移酶)将期望的核苷酸掺入序列中来制备单链核酸片段，诸如寡核苷酸。初始批次的单链核酸片段可被选择为使得它们具有重叠区，所述重叠区包含核苷酸(碱基)的互补序列，因此当将相应片段放在一起时，它们可能以正确的次序杂交。然而，将核苷酸掺入寡核苷酸中固有地包括错误，所述错误以随机分布遍布单链核酸片段发生。例如，错误可由于将有误的碱基掺入寡核苷酸、由于将附加的碱基插入寡核苷酸、在当至少一个另外的碱基应被添加时某一寡核苷酸停止生长超过某一点的情况下由于截短，或者在片段的某个碱基被省略，并且随后该片段继续增长为下一个碱基接合至前一个碱基，它们之间已跳过了至少一个碱基的情况下由于缺失而发生。一些技术可用于检测核酸片段内的某些掺入错误，但是这些技术可能很昂贵且并不完美，因此一批单链核酸片段仍可能包含合理比例的错误。因此，在合成双链核酸的典型方法中，将一批不同的单链核酸片段置于共同的容器中，并基于匹配的重叠区进行杂交。然而，初始单链核酸片段中掺入错误的存在意味着无错误地形成的最终靶标双链核酸的产率可相对较低。通常，在杂交过程完成后，能够鉴定出核酸的错误双链部分。例如，这可以使用克隆来完成，其中从制造的靶标双链核酸批次中进行随机选择，并将该样本提供给宿主(例如细菌宿主)，随后所述宿主可用于生成随机选择的样本的多个拷贝。然后可以使用测序来确定所选样本是否没有错误。许多平行的克隆系可以对从制造的靶标双链核酸样本中随机选择出的不同批次进行操作。然后取决于产率，一定百分比的这些克隆系可返回更大量的无错误靶标双链核酸样本。然而，该方法的问题在于克隆相对昂贵且缓慢，并且使用常规技术通常获得的产率太低以至于在实践中需要许多克隆系来提供足够的机会使所述克隆系中的一个将生成无错误样本。实际上，错误掺入率意味着能够人工合成而不是使用用宿主生成的克隆片段的杂交而合成的双链核酸的最大长度(碱基对数)，是相对较低的，并且人工合成双链核酸的基因长度序列仍是不切实际的。这是因为根据幂次定律，错误的可能性与双链核酸的长度成比例，因此对于较长的靶标序列，产率会大大降低。至少一些示例提供了从多个核酸片段提供靶标双链核酸的一个或多个实例(instances)的方法，所述方法包括：多个初始杂交步骤，每个初始杂交步骤包括使相应成对的部分重叠的核酸片段杂交以形成多个杂交片段；以及一个或多个另外的杂交步骤，每个另外的杂交步骤包括使作为对应的成对较早杂交步骤的直接产物的相应成对的部分重叠的杂交片段杂交以形成较长的杂交片段，其中所述成对的较早杂交步骤中的每一个均包括所述初始杂交步骤中的一个或所述另外的杂交步骤中的一个；其中所述一个或多个另外的杂交步骤包括至少一个另外的杂交步骤，对所述至少一个另外的杂交步骤来说，所述对应的成对较早杂交步骤二者都包括错误检测类型的杂交步骤；所述错误检测类型的杂交步骤包括：执行错误检测操作以检测在所述错误检测类型的杂交步骤中形成的所述杂交片段是否包括至少一个错误杂交片段，所述至少一个错误杂交片段在于所述错误检测类型的杂交步骤中杂交的重叠区中包含至少一个错配碱基对；以及丢弃所述至少一个错误片段的至少部分以将所述至少一个错误片段从后续另外的杂交步骤中排除；其中所述靶标双链核酸包含与单链核酸第二链杂交的单链核酸第一链；并且在每个杂交步骤中，在所述杂交步骤中形成的核酸杂交片段经由所述第一链或所述第二链与反应位点的表面结合。至少一些示例提供了计算机可读程序或数据结构，所述计算机可读程序或数据结构包括用于控制设备以执行上述方法的指令或控制数据。所述计算机程序或数据结构可存储在存储介质上。所述存储介质可以是非暂时性存储介质。提供了这样的杂交序列，所述杂交序列包括用于使核酸片段杂交的多个初始杂交步骤，以及一个或多个另外的杂交步骤，其中每个另外的杂交步骤使成对的重叠杂交片段杂交，所述成对的重叠杂交片段是对应的成对较早杂交步骤(所述对应的成对较早杂交步骤可以是两个较早的初始杂交步骤、两个较早的另外杂交步骤，或一个较早的初始杂交步骤和一个较早的另外杂交步骤)的直接产物。每个另外的杂交步骤均作用于成对较早杂交步骤的直接产物，因为所述每个另外的杂交步骤作用于成对较早杂交步骤中产生的相同分子，而不是例如作用于由细菌宿主从在较早的杂交步骤中产生的分子复制的克隆分子。因此，杂交序列可以相对较快地完成。对于至少一个另外的杂交步骤，提供要在该另外的杂交步骤中杂交的片段的成对较早杂交步骤二者均是错误检测类型的杂交步骤。错误检测类型的杂交步骤包括错误检测操作，所述错误检测操作用于检测在错误检测步骤中形成的杂交片段是否包括至少一个错误片段，所述至少一个错误片段在于该杂交步骤中杂交的重叠区中具有至少一个错配碱基对。如果检测到错误片段，则将错误片段的至少部分丢弃以将所述部分从后续另外的杂交步骤中排除。因此，通过确保馈入给定的另外的杂交步骤的两个较早的杂交步骤均包括错误检测，将来自成对的较早杂交步骤中的一个的更多“良好”片段与来自成对较早杂交步骤中的另一个的“良好”片段配对。这通过将“良好”片段与错误的片段配对而减少了“良好”片段的浪费，这是导致使用现有技术增加长度时产率急剧下降的主要原因。可以在仍对成对较早杂交步骤的直接产物执行后续杂交的同时执行错误检测操作，因此无需将较早杂交步骤的结果输出，到例如细菌宿主，这将是缓慢且昂贵，以执行错误检测。与使用现有技术时可行的情况相比，通过提高产率，可以更快且更成本有效地执行DNA或其他双链核酸的人工合成，以提供给定量的靶标双链核酸。为了使得能够在错误检测类型的杂交步骤中以及在后续的杂交步骤之前执行错误检测操作，以便能够从该下一杂交步骤中排除错误片段，可能需要对特定片段的杂交的次序和时机进行一定程度的控制。用于进行此的一种方法可以是将样本从一个容器手动或自动控制移液到另一个容器中，以控制片段被放在一起的顺序，并防止不同容器中的片段杂交，直到已经对在较早的杂交中产生的片段执行了错误检测为止。然而，一种较快且较不劳动密集的方式可以是使用一种设备来执行该方法，该设备具有在预定方向上对准的反应位点的至少一个泳道；以及流体控制元件，所述流体控制元件用于以所述预定方向引导每个反应位点上的流动流体。利用此类设备，流动流体可用于将片段从一个反应位点传输到另一反应位点。该设备还可在每个反应位点处包括独立受控的“阱”(例如，由静电电场或振荡电场，或磁场与铁珠的组合提供)，以促进片段从一个反应位点转移到另一个反应位本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从多个核酸片段提供靶标双链核酸的一个或多个实例的方法，所述方法包括：/n多个初始杂交步骤，每个初始杂交步骤包括使相应成对的部分重叠的核酸片段杂交以形成多个杂交片段；以及/n一个或多个另外的杂交步骤，每个另外的杂交步骤包括使作为对应的成对较早杂交步骤的直接产物的相应成对的部分重叠的杂交片段杂交以形成较长的杂交片段，其中所述成对的较早杂交步骤中的每一个均包括所述初始杂交步骤中的一个或所述另外的杂交步骤中的一个；/n其中所述一个或多个另外的杂交步骤包括至少一个另外的杂交步骤，对所述至少一个另外的杂交步骤来说，所述对应的成对较早杂交步骤二者都包括错误检测类型的杂交步骤；/n所述错误检测类型的杂交步骤包括：/n执行错误检测操作以检测在所述错误检测类型的杂交步骤中形成的所述杂交片段是否包括至少一个错误杂交片段，所述至少一个错误杂交片段在于所述错误检测类型的杂交步骤中杂交的重叠区中包含至少一个错配碱基对；以及/n丢弃所述至少一个错误片段的至少部分以将所述至少一个错误片段从后续另外的杂交步骤中排除；/n其中所述靶标双链核酸包含与单链核酸第二链杂交的单链核酸第一链；并且/n在每个杂交步骤中，在所述杂交步骤中形成的核酸杂交片段经由所述第一链或所述第二链与反应位点的表面结合。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170929 GB 1715852.8;20171220 GB 1721441.21.一种从多个核酸片段提供靶标双链核酸的一个或多个实例的方法，所述方法包括：
多个初始杂交步骤，每个初始杂交步骤包括使相应成对的部分重叠的核酸片段杂交以形成多个杂交片段；以及
一个或多个另外的杂交步骤，每个另外的杂交步骤包括使作为对应的成对较早杂交步骤的直接产物的相应成对的部分重叠的杂交片段杂交以形成较长的杂交片段，其中所述成对的较早杂交步骤中的每一个均包括所述初始杂交步骤中的一个或所述另外的杂交步骤中的一个；
其中所述一个或多个另外的杂交步骤包括至少一个另外的杂交步骤，对所述至少一个另外的杂交步骤来说，所述对应的成对较早杂交步骤二者都包括错误检测类型的杂交步骤；
所述错误检测类型的杂交步骤包括：
执行错误检测操作以检测在所述错误检测类型的杂交步骤中形成的所述杂交片段是否包括至少一个错误杂交片段，所述至少一个错误杂交片段在于所述错误检测类型的杂交步骤中杂交的重叠区中包含至少一个错配碱基对；以及
丢弃所述至少一个错误片段的至少部分以将所述至少一个错误片段从后续另外的杂交步骤中排除；
其中所述靶标双链核酸包含与单链核酸第二链杂交的单链核酸第一链；并且
在每个杂交步骤中，在所述杂交步骤中形成的核酸杂交片段经由所述第一链或所述第二链与反应位点的表面结合。


2.根据权利要求1所述的方法，其中在给定反应位点处执行的所述至少一个另外的杂交步骤中的一个包括使以下项杂交：
第一杂交片段，所述第一杂交片段经由所述第一链和所述第二链中的一者与所述给定反应位点的表面结合；和
第二双链片段，所述第二双链片段当经由所述第一链和所述第二链中的另一者与较早的反应位点的表面结合时在较早的杂交步骤中在所述较早的反应位点处形成。


3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述初始杂交步骤和所述至少一个另外的杂交步骤形成杂交步骤序列，在所述杂交步骤序列中，对于这样的任何成对杂交步骤，在所述任何成对杂交步骤中所述对的第二杂交步骤使在所述对的第一杂交步骤中形成的杂交片段与另一片段杂交，在所述成对杂交步骤中形成的杂交片段分别经由所述第一链和所述第二链的相对链与对应的反应位点的表面结合。


4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述方法是使用这样的设备执行的，所述设备包括：在预定方向上对准的反应位点的至少一个泳道；以及流体控制元件，所述流体控制元件用于以所述预定方向引导每个反应位点上的流动流体。


5.根据权利要求4所述的方法，所述设备还包括温度控制电路，所述温度控制电路用于独立地控制每个反应位点处的温度。


6.根据权利要求4和5中任一项所述的方法，其中所述反应位点包含以下项中的一者：
表面的在相邻反应位点之间没有物理屏障的部分，和
表面的在相邻反应位点之间具有可选择性去除的物理屏障的部分。


7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述多个初始杂交步骤中的至少一个是所述错误检测类型的杂交步骤。


8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中每个初始杂交步骤均为所述错误检测类型的杂交步骤。


9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述另外的杂交步骤中的至少一个是所述错误检测类型的杂交步骤。


10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中每个另外的杂交步骤均为所述错误检测类型的杂交步骤。


11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述错误检测操作包括弱化形成每个检测到的错误杂交片段的部分重叠的片段之间的键；以及提供流体以洗去所述至少一个错误杂交片段的所述至少部分。


12.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修·詹姆斯·海因斯，拉克尔·玛丽亚·桑切斯库珀，丹尼尔·艾德里安·拜格雷夫，
申请(专利权)人：埃万奈蒂克有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB