肝癌诊断的生物标志物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术研究发现过表达RPS3能够促进肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、及上皮细胞向间充质细胞转化能力；反之亦然。将敲低RPS3的肝癌细胞株皮下注射裸鼠后，成瘤性降低。而在人群中同样发现，相比癌旁组织，RPS3在肝癌组织中高表达，且其高表达一定程度上影响患者预后生存率。在此基础上，本发明专利技术提供了一种肝癌诊断中的生物标志物及其在制备肝癌诊断试剂中的应用，所述生物标志物是RPS3基因或其mRNA或所述基因编码的蛋白或蛋白片段，并且该生物标志物还可用作筛选肝癌药物的药物靶点。

Biomarkers and kits for the diagnosis of liver cancer

【技术实现步骤摘要】
肝癌诊断的生物标志物及其试剂盒
本专利技术涉及生物医药领域，尤其是涉及肝癌诊断和治疗的生物医药技术，特别是涉及RPS3基因及其编码的蛋白作为肝癌诊断生物标志物和治疗靶点方面的应用，以及以RPS3为检测对象的肝癌诊断试剂盒、化合物4-羟基-2-亚甲基丁酸(5-甲酰基呋喃-2-甲)酯在制备治疗肝癌的药物中的应用。
技术介绍
原发性肝癌(primarylivercancer，PLC)是一种死亡率极高的原发性肝疾病，是全球范围最常见的恶性肿瘤之一。据不完全统计，全世界肝癌年增加超过60万人，新患肝癌55％发生在中国。原发性肝癌从病理形态上可分为块状型肝癌、结节型肝癌、弥漫型肝癌；从组织病理学上可分为肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)、肝内胆管细胞癌(intrahepaticcholangiocarecinoma，ICC)、混合型肝癌(combinedhepatocellularandcholangiocarecinoma)；根据癌细胞的分化程度，可分为高分化、中分化和低分化3个等级。临床中原发性肝癌中95％以上的细胞病理学分型为肝细胞癌。HCC的高度侵袭性和高复发率导致了HCC的高死亡率。肝癌起病隐匿，缺乏有效可靠的筛查手段，大多数患者被诊断时已处于肝癌晚期或终末期，错过了治疗的最佳时期，可用的治疗选择有限且无效。肝癌的发生发展是一种多基因参与，多种环境因素协同作用的过程。正常的肝细胞演变成肝癌细胞需要经历多个病理阶段，涉及多种分子事件，然而肝癌发生发展的详细分子机制尚不清楚。目前研究认为，肝癌发病的相关因素与乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒感染、黄曲霉素、水污染等因素高度密切相关。其发病机制与癌基因、抑癌基因、使DNA氧化损伤的生物和环境因素等有关。此外，肿瘤的浸润和转移也是肝癌发生发展的一个重要环节，其涉及到肿瘤细胞与宿主细胞间复杂的相互作用过程，参与的相关基因众多，有钙黏蛋白、免疫球蛋白超基因家族成员、整合素、基质金属蛋白激酶、金属蛋白激酶组织抑制蛋白等。因此，更深入的了解肝癌发病的分子机制，预测特定药物对于肝癌患者的有效性，寻找肝癌诊断和预后标志物，对肝癌做到早期诊断和早期治疗是当今医学科学工作者们的重要任务之一。RNA结合蛋白(RNAbindingproteins,RBPs)是一类可以在体内结合单链或双链RNA的蛋白分子，通过特定的RNA结构域识别mRNA的特异元件，介导RNA的剪接、多聚腺苷化作用、序列编辑、RNA转运、RNA稳定性维持及细胞内定位和翻译等众多生理进程。研究表明，RBPs能够在多个水平上调节RNA转录本的丰度和功能，促进肿瘤的发生。此外，RBPs在调节细胞发育，稳态和疾病的基因表达中极为重要，RNA结合蛋白的表达失调与多种人类疾病相关，包括肌肉萎缩，神经疾病和癌症等。
技术实现思路
核糖体蛋白S3(ribosomalproteinS3，RPS3)，是核糖体40S亚基的组成部分之一，形成翻译起始区域的一部分。该蛋白属于核糖体蛋白S3P家族，由基因RPS3编码。对该基因已发现编码不同亚型的多个可变的剪接转录变体。本专利技术的专利技术人在肝癌的各细胞系中对基因RPS3的功能进行研究，发现过表达RPS3能够促进肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、及上皮细胞向间充质细胞转化能力；反之，敲低RPS3能够抑制细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、及上皮细胞向间充质细胞转化能力。将敲低RPS3的肝癌细胞株皮下注射裸鼠，与非敲低的肝癌细胞株相比，前者的成瘤性降低，无论是肿瘤的重量还是体积都低于后者。专利技术人在30例临床肝癌患者的癌组织和癌旁组织中对比检测了RPS3的表达情况，发现相比癌旁组织，RPS3在肝癌组织中高表达，且其高表达一定程度上影响患者预后生存率。以上研究结果显示，RPS3在肝癌进展中发挥着重要的作用，其表达水平增高会促进肝癌发展、浸润和转移，可用于预测肝癌患者的预后；而抑制其表达可以治疗肝癌。RPS3可能成为治疗肝癌的新靶点，并可用作筛选肝癌药物的药物靶点。本专利技术的专利技术人还发现了一种新的RPS3抑制剂——4-羟基-2-亚甲基丁酸(5-甲酰基呋喃-2-甲)酯(缩写为FMHM)，该化合物能够抑制肝癌的进展，用作肝癌治疗药物。专利技术人对肝癌细胞给药FMHM后，发现所述细胞的RPS3的表达降低，细胞增殖、克隆形成、细胞周期和伤口愈合能力均降低。而FMHM的抗肝癌活性能被RPS3过表达所逆转。由此证明FMHM抑制肝癌的作用机制之一可能是抑制了RPS3的表达或功能。在此基础上，专利技术人完成了本专利技术，并提出以下技术方案：一种用于肝癌预后判断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物是基因RPS3或其mRNA或所述基因编码的蛋白或蛋白片段。能够检测基因RPS3或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的检测试剂在制备肝癌患者预后判断的诊断试剂或诊断试剂盒中的用途。在本专利技术的一些实施方式中，所述诊断试剂或诊断试剂盒具有本专利技术如下描述的组成。一种肝癌预后判断的诊断试剂，其特征在于，包含能检测基因RPS3或其mRNA或其所编码的蛋白质或蛋白片段的检测试剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述检测试剂能够通过聚合酶链式反应定量或定性检测所述基因RPS3或其mRNA。在本专利技术的一个具体实施例中，所述检测试剂包含能特异性扩增基因RPS3的引物。在本专利技术的另一个实施例中，所述检测试剂包含能反转录基因RPS3的mRNA的引物，例如所述引物为：RPS3-RT-F:GCCAAAGGCTGCGAGGTTGTGGTGTCTG；RPS3-RT-R:GCGGCTCTGGCTTCCCACCCTTCTGTTC。优选，所述检测试剂中还包含DNA聚合酶，例如：Tag聚合酶。优选，所述检测试剂中还包含dNTP。优选，所述检测试剂中还包含反应用缓冲液。优选，所述检测试剂中还包含报告探针或者指示分子。在本专利技术的一个实施例中，所述报告探针是荧光标记的与基因RPS3的DNA链部分互补的寡核苷酸。优选，所述报告探针的5’端有荧光标签，3’端相应具有荧光淬灭标签；或者，所述报告探针的5’端有荧光淬灭标签，3’端相应具有荧光标签。在本专利技术的一个实施例中，所述指示分子是可以结合双链DNA的荧光物质，例如SYBRGreenI。在本专利技术的一种实施方式中，所述检测试剂能够通过碱基互补反应定量或定性检测基因RPS3或其mRNA。在本专利技术的一个具体实施例中，所述检测试剂包含能与基因RPS3发生杂交反应的核酸探针。在本专利技术的一个具体实施例中，所述检测试剂包含能与基因RPS3的mRNA发生杂交反应的核酸探针。优选，所述核酸探针上进一步结合指示分子。在本专利技术的又一种实施方式中，所述检测试剂能够通过抗原-抗体结合反应定量或定性检测基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段，其含有能够特异性结合基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段的抗体，优选所述抗体为单克隆抗体。在本专利技术中，能检测抗原-抗体结合反应的方法，包括但不限于：酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于肝癌预后判断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物是基因RPS3或其mRNA或所述基因编码的蛋白或蛋白片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于肝癌预后判断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物是基因RPS3或其mRNA或所述基因编码的蛋白或蛋白片段。


2.能够检测基因RPS3或其mRNA或其编码的蛋白或蛋白片段的检测试剂在制备肝癌患者预后判断的诊断试剂或诊断试剂盒中的用途。


3.一种肝癌预后判断的诊断试剂，其特征在于，包含能检测基因RPS3或其mRNA或其所编码的蛋白质或蛋白片段的检测试剂。


4.如权利要求3所述的诊断试剂，其特征在于，所述检测试剂能够通过聚合酶链式反应定量或定性检测所述基因RPS3或其mRNA；
优选，所述检测试剂包含能特异性扩增基因RPS3的引物；
优选，所述检测试剂包含能反转录基因RPS3的mRNA的引物；优选所述引物为：RPS3-RT-F:GCCAAAGGCTGCGAGGTTGTGGTGTCTG；RPS3-RT-R:GCGGCTCTGGCTTCCCACCCTTCTGTTC；
优选，所述检测试剂中还包含DNA聚合酶；
优选，所述检测试剂中还包含dNTP；
优选，所述检测试剂中还包含反应用缓冲液；
优选，所述检测试剂中还包含报告探针或者指示分子；
优选，所述报告探针是荧光标记的与基因RPS3的DNA链部分互补的寡核苷酸；优选，所述报告探针的5’端有荧光标签，3’端相应具有荧光淬灭标签；或者，所述报告探针的5’端有荧光淬灭标签，3’端相应具有荧光标签；
优选，所述指示分子是可以结合双链DNA的荧光物质。


5.如权利要求3所述的诊断试剂，其特征在于，所述检测试剂能够通过碱基互补反应定量或定性检测基因RPS3或其mRNA；
优选，所述检测试剂包含能与基因RPS3发生杂交反应的核酸探针；
优选，所述检测试剂包含能与基因RPS3的mRNA发生杂交反应的核酸探针；
优选，所述核酸探针上进一步结合指示分子。


6.如权利要求3所述的诊断试剂，其特征在于，所述检测试剂能够通过抗原-抗体结合反应定量或定性检测基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段，其含有能够特异性结合基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段的抗体，优选所述抗体为单克隆抗体；
优选，所述通过抗原-抗体结合反应定量或定性检测的试剂是ELISA试剂，其中包含能够特异性结合基因RPS3编码的蛋白或蛋白片段的第一抗体；
优选，所述ELISA试剂中进一步包含结合有指示分子的第二抗体，所述第二抗体可特异性结合RPS3编码的蛋白或蛋白片段，第二抗体和...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩丽敏，赵丽君，胡克新，童坦君，陈军，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11