一种碘克沙醇密度梯度离心纯化虫卵的方法技术

本发明专利技术涉及一种碘克沙醇密度梯度离心纯化虫卵的方法，属于虫卵纯化技术领域。本发明专利技术所述方法包括以下步骤：1)将含虫卵样品进行破碎和均质；2)将匀浆与次氯酸钠水溶液混合进行消化，过筛，得到滤液；3)将滤液进行离心，得到的沉淀用饱和食盐水进行悬浮，离心，得到上清液；4)将上清液与水混合，离心，得到第一沉淀；5)将第一沉淀和次氯酸钠水溶液混合，在冰上放置，离心，得到第二沉淀；6)将第二沉淀溶于TE缓冲液中，得到TE虫卵悬浮液，进行碘克沙醇密度梯度离心，得到纯化虫卵。本发明专利技术所述方法能够从粪便和盲肠内容物中纯化出高纯度虫卵，这些高纯度虫卵可进一步用于体外培养、疫苗研发和分子生化研究。

【技术实现步骤摘要】
一种碘克沙醇密度梯度离心纯化虫卵的方法
本专利技术涉及虫卵纯化
，具体涉及一种碘克沙醇密度梯度离心纯化虫卵的方法。
技术介绍
当前球虫虫卵纯化方式有饱和食盐水、蔗糖溶液和Percoll密度梯度离心等方式。饱和食盐水纯化不能得到特别纯净的球虫卵囊，里面容易混杂有杂质。仅可用于粗提纯卵囊。Percoll梯度溶液的缺点是常常需要在分析前去除胶体硅颗粒，用沉降法来去除胶体硅也会由于卵囊进入形成的胶状沉淀中而造成损失，如果需要去除溶质，可在纯化的卵囊不损失的情况下，只用两倍体积缓冲液稀释过后就可从梯度收集中沉降下来。迄今为止，缺乏有效的简便操作方式来纯化虫卵囊，现有方法存在杂质污染，或者纯化手段需要超速离心机仪器或制备浓度梯度较为繁琐，或不能完全满足分子生物学实验的纯度要求，如基因组测序和疫苗研发等分子生物学领域，因此亟待需要一种简便快速获得高度纯化的球虫卵囊的纯化方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种碘克沙醇密度梯度离心纯化虫卵的方法。本专利技术所述方法能够从粪便和盲肠内容物中高效纯化出高纯度虫卵，这些高纯度虫卵可进一步用于体外培养、疫苗研发和分子生化(基因组、蛋白质测序)研究。本专利技术提供了一种碘克沙醇密度梯度离心纯化虫卵的方法，包括以下步骤：1)将含虫卵样品进行破碎和均质，得到匀浆；2)将步骤1)得到的匀浆与次氯酸钠水溶液混合进行消化，依次过60目、100目和200目筛，得到滤液；3)将步骤2)得到的滤液进行第一离心，得到的沉淀用饱和食盐水进行悬浮，第二离心，得到上清液；4)将步骤3)得到的上清液与水混合，第三离心，得到第一沉淀；5)将步骤4)得到的第一沉淀和次氯酸钠水溶液混合，在冰上放置20～30min，第四离心，得到第二沉淀；6)将步骤5)得到的第二沉淀溶于TE缓冲液中，得到TE虫卵悬浮液，将TE虫卵悬浮液进行碘克沙醇密度梯度离心，所述碘克沙醇密度梯度离心为依次加入等体积的ρ＝1.121的碘克沙醇水溶液、ρ＝1.089的碘克沙醇水溶液、ρ＝1.058的碘克沙醇水溶液和TE虫卵悬浮液，12,000g4℃离心60min，取ρ＝1.089的碘克沙醇水溶液和ρ＝1.058的碘克沙醇水溶液之间出现的均一的条带，得到纯化虫卵。优选的是，步骤1)所述含虫卵样品包括含虫卵的粪便和/或盲肠内容物。优选的是，所述虫卵包括球虫虫卵、蠕虫虫卵或原虫虫卵。优选的是，所述第一离心和第三离心的条件为3000rpm，10min，所述第二离心的条件为2000rpm，10min，所述第四离心的条件为12000rpm，5min。优选的是，步骤2)和步骤5)所述次氯酸钠水溶液中次氯酸钠的质量百分含量独立的为10～20％。优选的是，步骤3)后，当杂质较多时，还包括重复步骤3)的离心、悬浮和离心操作。优选的是，步骤4)所述上清液与4～5倍体积的水混合。优选的是，步骤6)所述TE缓冲液含50mMTris-HCl和10mMEDTA；pH值为7.2。优选的是，步骤6)所述TE虫卵悬浮液中，虫卵的质量体积浓度为1～2g/mL。优选的是，步骤6)所述加入的速度为不超过0.15mL/sec。本专利技术提供了一种碘克沙醇密度梯度离心纯化虫卵的方法。本专利技术建立了一种改良的、碘克沙醇密度梯度离心方法来纯化粪便和肠道内容物中的虫卵。本专利技术设置了密度梯度，使得虫卵能获得均一的条带，然后通过将其吸出进行纯化。通过添加次氯酸钠水溶液，能够高效杀灭细菌和真菌，排除细菌和真菌的污染。本专利技术所述方法采用普通的离心机即可获得纯化虫卵，无需使用超速离心机，即可获得均一的条带，获得高度纯化的虫卵，耗费成本低、投入时间少。本专利技术所述方法还能适用于兔球虫卵，或蠕虫、原虫虫卵的纯化。试验结果表明，本专利技术利用碘克沙醇密度梯度离心对虫卵进行纯化，得到了无任何碎屑和微生物体的纯化虫卵。附图说明图1为本专利技术提供的从盲肠内容物中获得纯化虫卵步骤；图2为本专利技术提供的虫卵条带显示图；图3为10倍镜下艾美耳球虫虫卵；图4为40倍镜下艾美耳球虫虫卵。具体实施方式本专利技术提供了一种碘克沙醇密度梯度离心纯化虫卵的方法，包括以下步骤：1)将含虫卵样品进行破碎和均质，得到匀浆；2)将步骤1)得到的匀浆与次氯酸钠水溶液混合进行消化，依次过40目和100目筛，得到滤液；3)将步骤2)得到的滤液进行第一离心，得到的沉淀用饱和食盐水进行悬浮，第二离心，得到上清液；4)将步骤3)得到的上清液与水混合，第三离心，得到第一沉淀；5)将步骤4)得到的第一沉淀和次氯酸钠水溶液混合，在冰上放置20～30min，第四离心，得到第二沉淀；6)将步骤5)得到的第二沉淀溶于TE缓冲液中，得到TE虫卵悬浮液，将TE虫卵悬浮液进行碘克沙醇密度梯度离心，所述碘克沙醇密度梯度离心为依次加入等体积的ρ＝1.121的碘克沙醇水溶液、ρ＝1.089的碘克沙醇水溶液、ρ＝1.058的碘克沙醇水溶液和TE虫卵悬浮液，12,000g4℃离心60min，取ρ＝1.089的碘克沙醇水溶液和ρ＝1.058的碘克沙醇水溶液之间出现的均一的条带，得到纯化虫卵。本专利技术将含虫卵样品进行破碎和均质，得到匀浆。在本专利技术中，所述含虫卵样品优选包括含虫卵的粪便和/或盲肠内容物。在本专利技术中，所述虫卵优选包括球虫虫卵、蠕虫虫卵或原虫虫卵。当所述含虫卵样品为含球虫虫卵的粪便或盲肠内容物时，所述虫卵样品的来源优选包括禽类、哺乳类和畜类动物，所述禽类动物优选包括鸡、鸭、鹅和鸽，所述哺乳类动物优选包括兔子、犬、猫和啮齿类(实验动物大鼠、小鼠、地鼠、豚鼠)，所述畜类优选包括牛、山羊和猪。在本专利技术具体实施例中，所述含虫卵样品为含柔嫩艾美耳球虫虫卵的鸡粪便或盲肠内容物。本专利技术所述破碎和均质采用常规方法即可，将内容物破碎，如采用组织匀浆机(如对盲肠内容物，匀浆三次，观察破碎情况，若未完全破碎可再进行一次，直至肠管破碎完全)。得到匀浆后，本专利技术将匀浆与次氯酸钠水溶液混合进行消化，依次过60目、100目筛和200目筛，得到滤液。在本专利技术中，所述次氯酸钠水溶液中次氯酸钠的质量百分含量为10～20％，更优选为15％。在本专利技术中，60目、100目和200目筛特定组合过滤设置可以有效去除饲料和消化后的肠道组织，以便得到更纯的卵囊。采用次氯酸钠溶液消化可将肠道组织进行消化，裂解肠粘膜使得卵囊从肠道组织中释放出来。得到滤液后，本专利技术将滤液进行第一离心，得到的沉淀用饱和食盐水进行悬浮，第二离心，得到上清液。在本专利技术中，所述第一离心的条件为3000rpm离心10min。在本专利技术中，所述第二离心的条件优选为2000rpm离心10min。在本专利技术中，当杂质较多时，还包括重复上述的离心、悬浮和离心操作。在本专利技术中，用饱和食盐水悬浮能够起到初步提纯卵囊的作用，食盐水漂浮的上层为小于饱和食盐水的密度的球虫卵囊，而底部的为大于饱和食盐水密度的杂质，随后获取上层饱和食盐水中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种碘克沙醇密度梯度离心纯化虫卵的方法，包括以下步骤：/n1)将含虫卵样品进行破碎和均质，得到匀浆；/n2)将步骤1)得到的匀浆与次氯酸钠水溶液混合进行消化，依次过60目、100目和200目筛，得到滤液；/n3)将步骤2)得到的滤液进行第一离心，得到的沉淀用饱和食盐水进行悬浮，第二离心，得到上清液；/n4)将步骤3)得到的上清液与水混合，第三离心，得到第一沉淀；/n5)将步骤4)得到的第一沉淀和次氯酸钠水溶液混合，在冰上放置20～30min，第四离心，得到第二沉淀；/n6)将步骤5)得到的第二沉淀溶于TE缓冲液中，得到TE虫卵悬浮液，将TE虫卵悬浮液进行碘克沙醇密度梯度离心，所述碘克沙醇密度梯度离心为依次加入等体积的ρ＝1.121的碘克沙醇水溶液、ρ＝1.089的碘克沙醇水溶液、ρ＝1.058的碘克沙醇水溶液和TE虫卵悬浮液，12,000g 4℃离心60min，取ρ＝1.089的碘克沙醇水溶液和ρ＝1.058的碘克沙醇水溶液之间出现的均一的条带，得到纯化虫卵。/n

【技术特征摘要】
1.一种碘克沙醇密度梯度离心纯化虫卵的方法，包括以下步骤：
1)将含虫卵样品进行破碎和均质，得到匀浆；
2)将步骤1)得到的匀浆与次氯酸钠水溶液混合进行消化，依次过60目、100目和200目筛，得到滤液；
3)将步骤2)得到的滤液进行第一离心，得到的沉淀用饱和食盐水进行悬浮，第二离心，得到上清液；
4)将步骤3)得到的上清液与水混合，第三离心，得到第一沉淀；
5)将步骤4)得到的第一沉淀和次氯酸钠水溶液混合，在冰上放置20～30min，第四离心，得到第二沉淀；
6)将步骤5)得到的第二沉淀溶于TE缓冲液中，得到TE虫卵悬浮液，将TE虫卵悬浮液进行碘克沙醇密度梯度离心，所述碘克沙醇密度梯度离心为依次加入等体积的ρ＝1.121的碘克沙醇水溶液、ρ＝1.089的碘克沙醇水溶液、ρ＝1.058的碘克沙醇水溶液和TE虫卵悬浮液，12,000g4℃离心60min，取ρ＝1.089的碘克沙醇水溶液和ρ＝1.058的碘克沙醇水溶液之间出现的均一的条带，得到纯化虫卵。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述含虫卵样品包括含虫卵的粪便和/或盲肠内容物。


3.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲自刚，蔡建平，王恒，汪靖，张昆，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62