一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂及其制备方法与应用。本发明专利技术中的纳米级超声造影剂以脂质为壳膜材料，壳膜内部包裹有低分子量透明质酸和气态氟碳；脂质包含二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑叶酸；纳米级超声造影剂的粒径为255～497nm，能穿过肿瘤组织血管壁间隙，对于肿瘤的治疗具有被动靶向性和高效性；通过PEG链使耦合的叶酸在脂质壳膜外部，低分子量透明质酸包裹在造影剂内部，保证纳米级超声造影剂能够通过叶酸‑叶酸受体的方式主动靶向肿瘤相关巨噬细胞，并通过低分子量透明质酸作用于肿瘤相关巨噬细胞，使其从M2型巨噬细胞转化为M1型巨噬细胞。

A lipid nano ultrasound contrast agent targeting tumor associated macrophages and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂及其制备方法与应用，属于超声分子影像学

技术介绍
巨噬细胞在病理条件下表现出连续的功能激活状态，M1型和M2型用于表示巨噬细胞活化状态的两个极端，这两种活化类型在免疫和炎症反应中起相反的作用。肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophage,TAM)是M2型巨噬细胞的一种特殊类型，可以促进肿瘤新生血管形成、促进细胞外基质的重塑，从而促进肿瘤的发生和转移，是肿瘤微环境中的主要免疫成分，在原发肿瘤的发生，转移器官的扩散、播种和增殖中起着至关重要的作用。此外，TAM的密度与肿瘤的进展和预后密切相关。鉴于巨噬细胞的功能具有可塑性，与直接杀死TAM相比，促进其从M2型(促肿瘤)巨噬细胞转化为M1型(抗肿瘤)巨噬细胞是更好的选择。另外，与肿瘤细胞相比，TAM在遗传上是稳定的，因此不易产生放化疗抵抗。并且，TAM主要位于肿瘤基质的边缘区域，易于与通过血液循环到达的治疗药物相互作用。综上所述，TAM是肿瘤治疗方案中的重要治疗靶点。常用的几种靶向TAM的分子或受体包括IL-4R，甘露糖受体和叶酸受体β(folatereceptorβ,FRβ)。但IL-4R也存在于除TAM外的其他免疫细胞如T或B细胞表面，而甘露糖受体在内皮细胞亚群中也有高表达。FRβ在人TAM表面高表达，而在正常组织不表达或低表达，因此可以选择FRβ作为靶向TAM的靶点。作为药物输送系统(drugdeliverysystem,DDS)，纳米级超声造影剂在肿瘤靶向治疗中具有较大的优势，其可与医用诊断超声联合进行实时监控，在特定的时间和位置释放药物，并通过超声靶向纳泡破坏(ultrasoundtargetednanobubbledestruction,UTND)增强细胞对药物的吸收能力。目前尚未见到TAM靶向的纳米级超声造影剂的相关研究。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的脂质纳米级超声造影剂及其制备方法，以脂质为壳膜材料、全氟丙烷为气体内核制备纳米级超声造影剂，该造影剂显像持久，能够经医用超声仪靶向爆破，生物安全性高，具有较强的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的靶向结合能力。本专利技术还提供了上述靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的脂质纳米级超声造影剂在促进肿瘤相关巨噬细胞(TAM)从M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化中的用途。术语说明：肿瘤相关巨噬细胞：(tumorassociatedmacrophage,TAM)，是巨噬细胞的一种活化类型，是肿瘤微环境中的主要免疫成分。TAM是M2型巨噬细胞的一种特殊类型，可以促进肿瘤新生血管形成、促进细胞外基质的重塑，从而促进肿瘤的发生和转移。低分子量透明质酸：(lowmolecularweighthyaluronicacid,LMW-HA)，分子量在3-10kDa的透明质酸。DSPE-PEG-FOL：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸。DSPE-PEG-FITC：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-异硫氰酸荧光素。DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱。HA-FOL-NB：叶酸修饰的携载低分子量透明质酸的纳米级超声造影剂。FOL-NB：叶酸修饰的纳米级超声造影剂。NB：无靶向修饰、未携载低分子量透明质酸的纳米级超声造影剂。室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。本专利技术的技术方案如下：一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂，所述纳米级超声造影剂以脂质为壳膜材料，壳膜内部包裹有低分子量透明质酸和气态氟碳；所述脂质包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)；所述纳米级超声造影剂的粒径为255～497nm。根据本专利技术优选的，所述脂质和低分子量透明质酸的质量比为(5～10):1；进一步优选的质量比为7.5:1。根据本专利技术优选的，所述二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)的质量比为(1～7):(1～4):(1～4)；进一步优选的质量比为7:2:4。根据本专利技术优选的，所述气态氟碳为全氟丙烷。根据本专利技术优选的，所述纳米级超声造影剂的平均粒径为342nm。本专利技术中，所述靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂，以叶酸为靶向配体，以肿瘤相关巨噬细胞表面的叶酸受体β为受体，进行肿瘤相关巨噬细胞的靶向结合。叶酸作为靶向配体，具有亲和力高，稳定性好的优点，叶酸在体内和在储存过程中均以维生素的形式存在，容易与多种治疗剂结合，无免疫原性，并且能溶解于有机溶剂、酸和碱。本专利技术中，所述靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂中的低分子量透明质酸能够促进肿瘤相关巨噬细胞从M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化，并且这种转化作用不受巨噬细胞初始激活状态的影响。透明质酸在水溶性、生物相容性、和非免疫原性方面具有卓越的特性。上述一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂的制备方法，包括步骤如下：(1)将甘油与磷酸盐缓冲液混匀制成水合液，取丙二醇与水合液混匀后，按比例加入二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)，得混悬液；(2)向步骤(1)的混悬液中通入气态氟碳置换出空气，水浴加热至脂质完全溶解得乳浊液；(3)按比例向步骤(2)脂质完全溶解后的乳浊液中加入低分子量透明质酸，机械振荡80～100s后静置，取下层液并用磷酸盐缓冲液稀释后低速离心，取上层混悬液即得靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述水合液中甘油和磷酸盐缓冲液的体积比为1:9。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述丙二醇和水合液的体积比为1:1。根据本专利技术优选的，步骤(1)和(3)中所述磷酸盐缓冲液的组分为：Na2HPO48mM，KH2PO42mM，pH7.2。根据本专利技术优选的，步骤(2)中所述水浴加热的温度为50℃～70℃；进一步优选为65℃。根据本专利技术优选的，步骤(3)中所述低速离心为200～500rpm离心3～7min；进一步优选为300rpm离心5min。根据本专利技术优选的，步骤(3)中所述下层液与稀释用磷酸盐缓冲液的体积比为1:3。上述纳米级超声造影剂联合超声辐照在促进肿瘤相关巨噬细胞从M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化中的用途。以上本专利技术制备方法中未特别说明的均按照现有技术。本专利技术的技术特点：本专利技术制备的纳米级超声造影剂，以叶酸为靶向配体，以低分子量透明质酸为药物制剂，在制备纳米级超声造影剂时，将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂，其特征在于，所述纳米级超声造影剂以脂质为壳膜材料，壳膜内部包裹有低分子量透明质酸和气态氟碳；所述脂质包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)；所述纳米级超声造影剂的粒径为255～497nm。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂，其特征在于，所述纳米级超声造影剂以脂质为壳膜材料，壳膜内部包裹有低分子量透明质酸和气态氟碳；所述脂质包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)；所述纳米级超声造影剂的粒径为255～497nm。


2.如权利要求1所述的一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂，其特征在于，所述脂质和低分子量透明质酸的质量比为(5～10):1。


3.如权利要求1所述的一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂，其特征在于，所述二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)的质量比为(1～7):(1～4):(1～4)。


4.如权利要求1所述的一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂，其特征在于，所述气态氟碳为全氟丙烷。


5.如权利要求1所述的一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂，其特征在于，所述纳米级超声造影剂的平均粒径为342nm。


6.权利要求1～5任一项所述的一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)将甘油与磷酸盐缓冲液混匀制成水合液，取...

【专利技术属性】
技术研发人员：李杰，孙霄，郭鲁，商蒙蒙，时丹丹，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：山东;37