一种超声分子探针及其制备方法技术

本发明专利技术涉及的一种超声分子探针，包括有脂质体纳米粒壳膜、包裹于壳膜内的液态氟碳以及壳膜表面携带的抗体，其特征在于：所述抗体为碳酸酐酶IX单抗，并且所述壳膜表面还携载有环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA，其中环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA的序列为SEQ ID NO：1。本发明专利技术涉及的超声分子探针体积小，不仅能够穿透血管内皮间隙且能够靶向寻找肾癌细胞，还能够经超声辐照后使包裹在超声分子探针内的液态氟碳发生液气相变，产生微泡和空化效应，增强血流背向散射、提高超声显像结果，而且能够特异性结合靶细胞，促进具有抑癌效应的靶siCREB摄入，抑制肾癌细胞的生长。

【技术实现步骤摘要】
一种超声分子探针及其制备方法
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种超声分子探针及其制备方法。
技术介绍
肾癌(简称为RCC)是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率近年来呈上升趋势，给患者的身心健康带来严重的危害。针对RCC发病率、死亡率较高及治疗效果较差等特点，RCC的早期诊断及有效的干预治疗显得尤为重要。临床上现有的影像学技术(如CT、超声及MRI等)及实验室肿瘤标志物筛查对于RCC的定性诊断、预后评价及转移复查均具有一定的难度。近年来，由传统医学影像技术和现代分子生物学相结合兴起的分子影像学技术，通过对超声分子探针的设计，凭借酶学激活、靶向分子结合等原理，使用表面修饰靶点、携带药物或基因的多功能分子探针，将基因表达、分子之间的信号传递过程以影像学方式直观显示，使得临床更好地了解疾病的发展特征，为RCC在分子或细胞水平的早期影像诊断及靶向精准治疗提供了新思路及手段。超声微泡作为一种内含气体的微米级超声造影剂，拥有较好的超声成像效果，目前已广泛应用于各种临床疾病的诊断(如声诺维SonoVue，平均直径约2.5μm)，同时，它也被作为一种能携带抗肿瘤药物或基因的载体用于实验研究。然而，传统的超声微泡微米级别的粒径大小不能通过肿瘤内皮细胞间隙而难以深入靶向血管外肿瘤组织。粒径微小的脂质体纳米粒可以顺利穿过肿瘤组织内皮细胞间隙，同时也能作为抗肿瘤药物/基因的载体进行抗肿瘤治疗，但是脂质体纳米粒也有不足之处：以聚集形式增强背向散射显影为原理的普通脂质体纳米粒其显像效果不如微米级的超声微泡。液态氟碳(简称为PFP)诱导的声致液滴相变效应(acousticdropletvaporation，简称为ADV)为脂质体纳米粒和超声微泡之间的强强联合带来了新希望。PFP的生物安全性较好为其用作超声分子探针核心材料提供了可能。更重要的是，据Rapoport等研究报道，除了温度以外，PFP的ADV的阈值(ΔP)还与微球的内外表面张力(σ)差即拉普拉斯压力有关，可根据以下公式获得：ΔP＝Pinside-Poutside＝2σ/r。由上述公式可见，ADV阈值与微球的粒径(r)有关，粒径越大，其发生ADV的温度要求就越低，反之越高。当微球粒径达到4μm，温度达到生理温度37℃时，其内包裹的液态氟碳PFP才能发生ADV。申请人前期的实验结果表明，PFP包裹进入脂质体纳米粒后并制备成纳米级，其ADV温度明显提高，有利于提高微球的稳定性。另外，在ADV研究中，超声强度、频率和脉冲模式的改变均可以影响ADV的阈值，其中超声强度、频率和时间的增加可下调其ADV温度，ADV后经低频聚焦超声(简称为LIFU)可产生空化效应，从而达到治疗效果。然而，申请人的前期实验表明，普通的脂质体纳米粒仍无法进行疾病的高效显像和治疗，因其缺乏靶向特性，到达靶组织的含量并不高。有文献报道，由于RCC患者的VHL突变丢失恒定，导致其下游碳酸酐酶IX(carbonicanhydraseIX,简称为CAIX)表达不受抑制，因此CAIX在ccRCC组织中呈现高表达，而在正常肾脏近端管上皮细胞中不表达，使得CAIX已然成为RCC的肿瘤标记物。CAIX作为碳酸酐酶家族中的一个成员，具有催化二氧化碳与水可逆性合成碳酸从而调节PH的能力，对维持肿瘤组织的酸性微环境具有重要的作用。有研究表明，CAIX介导了肿瘤的生长和转移功能，并且有助于PH调节、细胞增殖、黏着、转移和侵袭过程。Alexandra等在国际肾癌研讨会上介绍了CAIX抗体修饰的疫苗在治疗肾癌的早期试验结果，他们发现，经粒-巨噬细胞集落刺激因子融合基因转导的树突状细胞-CAIX疫苗可以有效、安全地靶向肾癌肿瘤表面细胞膜，帮助患者稳定病情。此外，Lamers等使用靶向CAIX的嵌合抗体修饰T细胞可以发挥抗原导向的靶向毒性，具有更强的抗肾癌能力。由此可见，肾癌表面CAIX是有效的特异性抗原，以CAIX为靶点的细胞或其他递送载体有望成为新的抗肾癌药物运输工具。由于肾癌对放、化疗均不敏感，因此基因疗法在抑制肾癌发生发展过程中显得格外重要。目前，肿瘤靶向治疗凭借其特异性与靶向性，在肿瘤治疗中发挥越来越重要作用，成为肿瘤治疗的主攻方向。靶向治疗，是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点(该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段)，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹”，为此，为了更好地对肾癌的早期诊断及并进行有效的干预治疗，需要找到肾癌治疗的新靶点及新手段。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种新的分子靶向治疗肾癌的超声分子探针。本专利技术所要解决的第二个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种超声分子探针的制备方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的第一个技术方案为：一种超声分子探针，包括有脂质体纳米粒壳膜、包裹于壳膜内的液态氟碳以及壳膜表面携带的抗体，其特征在于：所述抗体为碳酸酐酶IX单抗，并且所述壳膜表面还携载有环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA，其中环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA的序列为SEQIDNO：1，具体为：环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP-responseelementbindingprotein,简称为CREB)作为细胞内原癌性转录因子，其Ser-133位点受PKA、MAPK、PKC、CaMKs、CKⅡ等蛋白激酶磷酸化，招募CBP蛋白并结合靶基因启动子附近高度保守的cAMP反应元件，并诱导其乙酰化，激活并启动靶基因的转录功能。申请人在前期研究中发现，CREB在宫颈癌、肾癌和淋巴瘤中的表达水平显著性高于其癌旁组织，并且参与调控细胞周期、凋亡及侵袭相关蛋白表达，进而影响细胞发生发展的进程，而且，通过脂质体法转染环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA降低环腺苷酸反应元件结合蛋白的表达能显著性抑制肾癌细胞的发生发展。脂质体纳米粒是一定浓度的脂质囊泡和纳米粒分散在水溶液中自组装形成的具有脂质外壳和纳米粒核心的新型组装体。通过脂质体纳米粒包裹液态氟碳，使该超声分子探针能够穿透血管内皮间隙，壳膜上携载碳酸酐酶IX单抗，使该超声分子探针在穿透血管内皮间隙后能够靶向寻找肾癌细胞膜表面高表达的碳酸酐酶IX单抗的抗原，再经超声辐照后使液态氟碳发生液气相变，产生微泡和空化效应，增强血流背向散射、提高超声显像结果，还能增加靶细胞的通透性从而促进携载于脂质体纳米粒表面的环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA转染，通过降低肾癌组织中环腺苷酸反应元件结合蛋白的表达来性抑制肾癌细胞的发生发展，达到治疗效果。作为环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA序列的第一种设计，所述的环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA的正义链序列为：5’-GUCUCCACAAGUCCAAACATT-3’，反义链序列为：5’-GUCUCCACAAGUCCAAACATT-3’。作为环腺苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超声分子探针，包括有脂质体纳米粒壳膜、包裹于壳膜内的液态氟碳以及壳膜表面携带的抗体，其特征在于：所述抗体为碳酸酐酶IX单抗，并且所述壳膜表面还携载有环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA，其中环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA的序列为SEQID NO：1。/n

【技术特征摘要】
1.一种超声分子探针，包括有脂质体纳米粒壳膜、包裹于壳膜内的液态氟碳以及壳膜表面携带的抗体，其特征在于：所述抗体为碳酸酐酶IX单抗，并且所述壳膜表面还携载有环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA，其中环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA的序列为SEQIDNO：1。


2.根据权利要求1所述的超声分子探针，其特征在于，所述的环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA的正义链序列为：5’-GUCUCCACAAGUCCAAACATT-3’，反义链序列为：5’-GUCUCCACAAGUCCAAACATT-3’。


3.根据权利要求1所述的超声分子探针，其特征在于，所述的环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA的正义链序列为：5’-GGCAGACAGUUCAAGUCCAUG-3’，反义链序列为：5’-UGGACUUGAACUGUCUGCCCA-3’。


4.根据权利要求1所述的超声分子探针，其特征在于，所述的环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA的正义链序列为：5’-UAAUUCCUUCAAUACCAUGCU-3’，反义链序列为：5’-CAUGGUAUUGAAGGAAUUAGA-3’。


5.一种制备如权利要求1-4任一项所述的超声分子探针的方法，其特征在于，包括以下步骤，
步骤一：制备脂质体纳米粒壳膜；
步骤二：将步骤一获得的脂质体纳米粒壳膜中加入液态氟碳，得到内部包裹有液态氟碳的脂质体纳米粒；
步骤三：在步骤二中获得的内部包裹有液态氟碳的脂质体纳米粒表面负载环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA，得到表面携载有环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA的脂质体纳米粒；
步骤四：将步骤三获得的表面携载有环腺苷酸反应元件结合蛋白的siRNA的脂质体纳米粒与碳酸酐酶IX单抗进行酰胺反应，得到所述的超声分子探针。


6.根据权利要求5所述的制备超声分子探针的方法，其特征在于，步骤一中制备脂质体纳米粒壳膜的步骤为：
a、称取10mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱、3-4mg的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物、2-4mg的3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇放入圆底烧瓶中；
b、加入4-6mL氯仿和1-2mL甲醇，混合溶解；
c、旋转水浴蒸发，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄帅帅，古丽米热·图尔贡，任雨，王雪，翁国斌，祝杭婕，
申请(专利权)人：宁波市鄞州区第二医院医共体，
类型：发明
国别省市：浙江;33