禽用四联疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及禽用四联疫苗及其制备方法和应用，所述禽用四联疫苗为鸡新城疫、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病和禽腺病毒病四联疫苗，本发明专利技术将灭活的鸡新城疫病毒La Sota株、灭活的H9亚型禽流感病毒HB01株、传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白VP2和禽腺病毒的结构蛋白Fiber2混合配制成油水乳液。本发明专利技术提供的禽用四联疫苗安全性高、稳定性好、免疫保护持续期长、免疫母鸡后可为子代雏鸡提供长效的母源抗体、内毒素含量极低、免疫副反应小，且四种抗原相容性好，无不同抗原间的竞争和表达抑制情况，禽用四联苗中的四种组分均可达到各自单价灭活疫苗一样的免疫效果。

【技术实现步骤摘要】
禽用四联疫苗及其制备方法和应用
本专利技术涉及兽用生物制品领域，尤其涉及禽用四联疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
在鸡养殖产业，禽流感(H9亚型)和鸡新城疫一直处于较高的发病比例，特别是雏鸡和产蛋鸡因自身处于抵抗力较弱的阶段，极易发生感染，一旦发生便给养殖场造成巨大的经济损失，疫苗预防是养殖场防控禽流感(H9亚型)和鸡新城疫发生的关键措施之一，也是目前养殖场普遍采取的方式。目前传染性法氏囊病病毒基因不断发生变异，超强毒株感染病例不断出现，临床上发生免疫失败的情况越来越多，分析原因主要是目前使用的弱毒疫苗株与流行的超强毒株在基因及毒力层面已有较大差异，使用常规弱毒疫苗无法有效防止传染性法氏囊病病毒超强毒株的感染，另外由于发病日龄越来越早，导致中等毒力疫苗还没使用就已有传染性法氏囊病病毒的感染，目前养殖场迫切需要防控针对超强毒株的传染性法氏囊病疫苗。禽腺病毒(I群，4型)对多个品种的鸡和鸭均具有易感性，鸡的感染最为普遍，其引起的心包积水-肝炎综合征发病急，传播快，可引起雏鸡高死亡率(90％以上)，蛋鸡产蛋下降。目前尚无特效疗法，尚无商品化疫苗来预防，因此开发能防止本病安全有效的疫苗极其重要。目前的商品化疫苗多为传统疫苗，其所选用毒株分离年份较早，与当前流行毒株不管在基因上还是在抗原性上均存在较大差别(尤其是极易变异的RNA病毒)，由于免疫偏差的存在，即使鸡场反复多次免疫，也难以控制疫情的发展，同时也加剧了应激和疾病的易感性，降低了鸡群生产性能，增加了人力和物力投入，经济损失进一步加大。<br>
技术实现思路
本方案的目的是制备鸡新城疫、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(I群，4型)的四种抗原，通过四种抗原的配比，乳化制成鸡新城疫、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(I群，4型)四联灭活疫苗，有效防控鸡新城疫、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(I群，4型)，满足养禽业对鸡新城疫、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病、禽腺病毒病(I群，4型)的防控需求。第一方面，本专利技术提供一种禽用四联疫苗，所述禽用四联疫苗由鸡新城疫抗原部分、H9亚型禽流感抗原部分、传染性法氏囊病抗原部分和禽腺病毒病抗原部分制备而成；所述H9亚型禽流感抗原部分为灭活的H9亚型禽流感病毒HB01株。H9亚型禽流感病毒HB01株保藏号为CCTCCNO：V202017，于2020年01月07日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学；邮编为：430072，分类命名为：禽流感病毒(H9亚型)HB01株。该H9亚型禽流感病毒HB01株对鸡红细胞有凝集作用(即具有血凝性)，且其血凝性可被禽流感(H9亚型)阳性血清特异性抑制，该毒株经基因分型属禽流感H9N2型，符合H9亚型禽流感病毒的特征。进一步地，所述禽腺病毒抗原部分来源于表达禽腺病毒Fiber2蛋白的重组大肠杆菌Rosetta-rFiber2株，所述鸡新城疫病毒抗原部分为灭活的鸡新城疫LaSota株，所述传染性法氏囊病病毒抗原部分来源于表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组大肠杆菌Rosetta-rVP2株。进一步地，所述禽用四联疫苗由灭活的鸡新城疫病毒LaSota株、所述灭活的H9亚型禽流感病毒HB01株、传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白VP2和禽腺病毒的结构蛋白Fiber2组成。本专利技术选择的鸡新城疫部分的抗原组分为全毒灭活抗原，毒株选择的是鸡新城疫IV系经典毒株LaSota株。鸡新城疫IV系LaSota株也是目前防控鸡新城疫运用最普遍的一个经典疫苗株，近年来，在临床上分离鸡新城疫毒株普遍较少，也充分说明其防控效果。H9亚型禽流感部分的抗原组分同样为全毒灭活抗原，毒株选择的是2015年临床分离的H9亚型禽流感病毒HB01株，该毒株与近年(2014年-2018年)流行的H9亚型禽流感分离株具有较近的亲缘关系、在鸡胚上增殖稳定、滴度高、免疫原好、具有开发疫苗的潜质。传染性法氏囊病部分的抗原组分为传染性法氏囊病病毒衣壳蛋白-VP2蛋白，将近年流行的传染性法氏囊病病毒超强变异毒株的衣壳蛋白-VP2蛋白运用原核表达系统进行可溶性表达、纯化及去除内毒素后，作为传染性法氏囊病部分的抗原。禽腺病毒病(1群，4型)部分的抗原组分为Fiber2蛋白，将禽腺病毒(1群，4型)结构蛋白Fiber2蛋白运用原核表达系统进行可溶性表达、纯化及去除内毒素后，作为禽腺病毒病(1群，4型)部分的抗原。进一步地，所述灭活的鸡新城疫病毒LaSota株含量为108.0EID50/0.1ml～109.0EID50/0.1ml，所述灭活的H9亚型禽流感病毒HB01株含量为106.0EID50/0.1ml～108.0EID50/0.1ml，所述传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白VP2抗原琼扩效价为1：8～1：32，所述禽腺病毒的结构蛋白Fiber2含量为40～60μg/0.1ml。更近一步，所述灭活的鸡新城疫病毒LaSota株含量为108.0EID50/0.1ml，所述灭活的H9亚型禽流感病毒HB01株含量为107.0EID50/0.1ml，所述传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白VP2抗原琼扩效价为1：16，所述禽腺病毒的结构蛋白Fiber2含量为50μg/0.1ml。进一步地，所述禽用四联疫苗为油水乳液。本专利技术使用鸡新城疫病毒LaSota株、H9亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/01/2015(简称HB01株)分别接种易感鸡胚培养、收获鸡胚尿囊液、超滤浓缩、经甲醛灭活后作为抗原一和抗原二；用表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组大肠杆菌Rosetta(DE3)-rVP2株和表达禽腺病毒(I群，4型)Fiber2蛋白的重组大肠杆菌Rosetta(DE3)-rFiber2株分别经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、离心去除菌体碎片、提纯后作为抗原三和抗原四；将四种抗原按照一定比例混合后加入矿物油佐剂乳化制成。用于预防鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒和禽腺病毒(I群，4型)引起的相关疾病。第二方面，本专利技术提供上述禽用四联疫苗的制备方法，包括：将灭活的鸡新城疫病毒LaSota株、灭活的H9亚型禽流感病毒HB01株、传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白VP2和禽腺病毒的结构蛋白Fiber2稀释后充分混合的到抗原液；向所述抗原液中加入吐温-80后作为水相，和油相以1：1～3的比例混合后进行剪切乳化。优选将水相和油相以1：2的比例进行混合。进一步地，所述传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白VP2和所述禽腺病毒的结构蛋白Fiber2均由构建的原核表达系统通过大肠杆菌Rosetta株上清可溶性表达得到。进一步地，所述油相由如下重量份的成分组成：94份注射用白油、1～2份硬脂酸铝和6份司本80。组分优选制备方法为：注射用白油94份(以毫升为单位)，加硬脂酸铝1份(以克为单位)，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-806份(以毫升为单位)，混合后经121℃灭菌30min，冷却至室温备用。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种禽用四联疫苗，其特征在于，所述禽用四联疫苗由鸡新城疫抗原部分、H9亚型禽流感抗原部分、传染性法氏囊病抗原部分和禽腺病毒病抗原部分制备而成；/n所述H9亚型禽流感抗原部分为灭活的H9亚型禽流感病毒HB01株，所述H9亚型禽流感病毒HB01株的保藏号为CCTCC NO：V202017。/n

【技术特征摘要】
1.一种禽用四联疫苗，其特征在于，所述禽用四联疫苗由鸡新城疫抗原部分、H9亚型禽流感抗原部分、传染性法氏囊病抗原部分和禽腺病毒病抗原部分制备而成；
所述H9亚型禽流感抗原部分为灭活的H9亚型禽流感病毒HB01株，所述H9亚型禽流感病毒HB01株的保藏号为CCTCCNO：V202017。


2.根据权利要求1所述的禽用四联疫苗，其特征在于，所述禽腺病毒病抗原部分来源于表达禽腺病毒Fiber2蛋白的重组大肠杆菌Rosetta-rFiber2株，所述鸡新城疫抗原部分为灭活的鸡新城疫LaSota株，所述传染性法氏囊病抗原部分来源于表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组大肠杆菌Rosetta-rVP2株。


3.根据权利要求1所述的禽用四联疫苗，其特征在于，所述禽用四联疫苗由灭活的鸡新城疫病毒LaSota株、所述灭活的H9亚型禽流感病毒HB01株、传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白VP2和禽腺病毒的结构蛋白Fiber2组成。


4.根据权利要求3所述的禽用四联疫苗，其特征在于，所述灭活的鸡新城疫病毒LaSota株含量为108.0EID50/0.1ml～109.0EID50/0.1ml，所述灭活的H9亚型禽流感病毒HB01株含量为106.0EID50/0.1ml～108.0EID50/0.1ml，所述传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白VP2抗原琼扩效价为1：8～1：32，所述禽腺病毒的结构蛋白Fiber2含量为40～60μg/0.1ml。


5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐高原，张丽华，明凡，周明光，白红英，高尚，姚蓉，苏秀婵，王鑫，程泰烺，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42