一种烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆和应用制造技术

本发明专利技术公开了烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6及其克隆方法与应用，烟碱合成负向调控基因NtARF6核苷酸序列如SEQ ID：NO:1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：NO:2所示。本发明专利技术还公开了烟碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtARF6基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtARF6基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、构建了含NtARF6基因的过表达载体。将过表达载体通过农杆菌介导的转化在烟草中过表达，制备转基因植株。获得的转基因植株尼古丁含量平均下降36.2％；降烟碱含量平均下降50.5％；假木贼碱含量平均下降44.9％；新烟碱含量平均下降60.2％。说明烟草NtARF6基因在培育低烟草生物碱含量的烟草品种方面具有较大的应用前景。

Cloning and application of ntarf6, a negative regulatory gene for alkaloid synthesis in tobacco

【技术实现步骤摘要】
一种烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆和应用
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法与应用。
技术介绍
烟草(Nicotianatabacum)是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。烟碱是栽培烟草重要的特征化合物，占烟草总生物碱的95％左右。ARF(AuxinResponseFactor)类型的转录因子基因是普通烟草生长发育过程当中重要的调控因子。烟草中调控尼古丁生物合成的NIC2遗传位点已被发现是由至少7个乙烯响应因子ERF基因组成，如NtERF189，NtERF179等。近年来，随着基因组和测序技术的发展，正向调控烟草尼古丁生物合成调控因子已经基本明确，而且相关分子调控机理也逐渐清晰。相比之下，烟草中能够负向调控尼古丁生物合成的调控因子却鲜见报道。具相关文献报道，负向调控烟草尼古丁合成基本上是通过直接或间接影响不同植物激素之间的互作来实现的，比如生长素(IAA)、乙烯利(Ethylene)。我们通过对乙烯利处理后烟草根部组织转录组进行分析后获得NtARF6基因表达模式本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草烟碱合成负向调控基因NtARF6，其特征在于所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种烟草烟碱合成负向调控基因NtARF6，其特征在于所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。


2.根据权利要求1所述的烟草生物碱负向合成调控基因NtARF6，其特征在于所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。


3.一种权利要求1所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：
A、确定NtARF6基因序列；
根据乙烯利处理烟草根部组织转录组分析获得NtARF6基因序列。利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物NtARF6-BamHI：GGATCCATGAGGGTATCTTCAGCTGGGTTCA；
反向引物NtARF6-XhoI：CTCGAGTTACTGCCAGGGATCGTCACCGAGG；
B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、根据NtARF6基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μL-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化进入大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。


4.根据权利要求3所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法，其特征在于C步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×PhusionHF反应缓冲液10μL，10mMdNTP1μL，2U的High-FidelityDNAPolymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。


5.根据权利要求3所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的克隆方法，其特征在于C步骤中PCR扩增的反应条件是在pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟。


6.一种权利要求1或2所述的负向调控烟草叶片生物碱含量的基因NtARF6的过表达载体，其特征在于所述的负向调控烟草叶片生物碱含量的基因NtARF6的过表达载体为pK2GW7-NtARF6。


7.一种权利要求1所述的烟草生物合成负向调控基因NtARF6的应用，其特征在于所述的烟草生物合成负向调控基因NtARF6在用于获得烟草生物碱含量显著降低的转基因植株中的应用。


8.根据权利要求7所述的烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6的应用，其特征在于所述获得NtARF6转基因烟草的方法包括以下步骤：
A、过表达隆载体的构建：
1、克隆的NtARF6连接TOPO载体
(1)以烟草品种Coker176幼叶组织的cDNA为模板，利用NtARF6基因特异引物进行扩增，得到大小约为2.5kb的基因片段；纯化回收；
(2)将回收的NtARF6基因片段进行TOPO克隆，连接到-BluntⅡ-TOPO(3.5kb)载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，挑选扩增产物大小约为2.5kb的质粒提取DNA，构建的载体命名为pTOPO-NtARF6；
(3)由于基因上下游引物分别带有BamHI、XhoI的识别位点，因此选择这两个酶对检测正确的质粒样品进行双酶切检测，将目的基因片段胶回收；对pTOPO进行BamHI、XhoI双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文正，隋学艺，胡梦阳，王丙武，宋中邦，高玉龙，李梅云，赵璐，袁诚，张洪博，师君丽，李永平，孔光辉，曾建敏，邹聪明，刘勇，黄昌军，吴兴富，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53