一种检测甲基转移酶的单个量子点纳米传感器及其检测方法和应用技术

本发明专利技术提供一种检测甲基转移酶的单个量子点纳米传感器及其检测方法和应用，属于分子检测技术领域。所述纳米传感器至少包括：双链DNA探针，量子点和标记有荧光分子的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸；所述双链DNA探针设计有CpG甲基转移酶的识别位点。本发明专利技术以单个量子点为基础，开发出了一种具有CpG甲基胞嘧啶识别位点性能的纳米传感器。利用该传感器检测的CpG甲基转移酶具有更低的检测限，可比当前的方法低一到两个数量级，因此具有良好的实际应用之价值。

A single quantum dot nano sensor for detecting methyltransferase and its detection method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种检测甲基转移酶的单个量子点纳米传感器及其检测方法和应用
本专利技术属于分子检测
，具体涉及一种检测甲基转移酶的单个量子点纳米传感器及其检测方法和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。CpG岛序列甲基化作用是一种重要的表观遗传标记，并在发展与分化、基因组稳定性、基因组标记、X染色体失活中扮演着不可或缺的角色。异常的CpG岛序列甲基化与许多疾病相关，比如癌症。DNA甲基化主要取决于甲基转移酶的活性，因此，CpG甲基转移酶的检测对相关疾病的早期诊断至关重要。传统的CpG甲基转移酶检测主要有放射性标记甲基化和重亚硫酸盐两种方法，但均具有局限性：放射性物质的参与限制了前者的广泛应用，重亚硫酸盐被用来识别DNA中的胞嘧啶，而不是甲基胞嘧啶；这种方法由于从胞嘧啶到尿嘧啶的不完全转换，会导致样本DNA降解和假阳性率。此外，一些荧光方法和电化学免疫反应法也被用于CpG甲基转移酶检测，如基于甲基化敏感性内切酶HpaII的荧光法：HpaII内切酶用于切割具有胞嘧啶位点的特定DNA序列，不能切割相应含甲基胞嘧啶的DNA；由于限制性内切酶对特定DNA序列的不完全切割，这些方法也会出现假阳性率。而电化学免疫反应法则具有需要特异性抗体、灵敏度较差等缺点。因此，开发一种准确且高灵敏度的检测CpG甲基转移酶方法具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种检测甲基转移酶的单个量子点纳米传感器及其检测方法和应用。本专利技术以单个量子点为基础，开发出了一种具有CpG甲基胞嘧啶识别位点性能的纳米传感器。利用该传感器检测的CpG甲基转移酶具有更低的检测限，可比当前的方法低一到两个数量级。因此具有良好的实际应用之价值。为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一个方面，提供一种检测甲基转移酶的单个量子点纳米传感器，所述纳米传感器至少包括：双链DNA探针，量子点和标记有荧光分子的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸。其中，所述双链DNA探针设计有CpG甲基转移酶的识别位点(5’-G-C-G-mC-3’/3’-mC-G-mC-G-5’)；优选的，所述双链DNA探针5’末端上设计有生物素(biotin)，以连接被链亲和素包裹的量子点；3’末端设计有PO4，以阻止末端转移酶(TDT)的非特异性扩增；所述量子点为605QDs；本专利技术所用605QDs是一种streptavidin-coatedCdSe/ZnSQDs，所述量子点表面包被有链亲和素。所述荧光分子为花菁5(Cy5)，虽然现有技术已有多种可与量子点发生荧光共振能量转移的荧光染料分子，如TAMRA/Cy3/TexasRed/罗丹明等，但通过对比试验研究发现，605QDs/Cy5这一对组合在本专利技术所述方法中的荧光共振能量转移(FRET)效率更高。且在本专利技术中，多个Cy5受体结合到一个DNA分子上，随后，多个Cy5标记的双链DNA装配到一个605量子点上，从而使荧光共振能量转移效率得到进一步显著提高。本专利技术的第二个方面，提供上述纳米传感器在检测DNA甲基转移酶中的应用；所述DNA甲基转移酶为CpG甲基转移酶。本专利技术的第三个方面，提供一种检测CpG甲基转移酶的方法，所述方法包括：(1)将待测样品和双链DNA探针进行甲基化反应得甲基化产物；(2)将甲基化产物加入GlaI内切酶进行酶切反应；(3)将切割产物与末端转移酶，标记有荧光分子的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸混合得反应产物；(4)将反应产物与量子点混合，得量子点/探针/Cy5的结构。所述检测方法还包括采用荧光成像系统测定荧光信号，从而实现对CpG甲基转移酶的定量检测。具体的，测定荧光信号方法为：在405nm处激发QD并分别收集609.8nm(605QD)和670nm(Cy5)处的信号。本专利技术的第四个方面，提供上述纳米传感器和/或检测方法在DNA甲基转移酶活性检测和/或筛选DNA甲基转移酶药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术存在如下有益技术效果：(1)本专利技术不需要放射性标记物质、不需要特异性抗体，因而该方法降低了检测成本。与会出现假阳性率的识别胞嘧啶位点方法相比，具有甲基胞嘧啶识别位点性能。(2)多个生物素与Cy5标记的双链DNA装配到单个605量子点上，使荧光共振能量转移效率得到显著提高。(3)具有高灵敏度，最低检测限可达2.1×10-7U/μL，比现有技术低一到两个数量级。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为本专利技术纳米传感器检测机理图。图2(A)为dsDNA-1底物被CpG甲基转移酶甲基化和GlaI内切酶裂解之后的非变性聚丙烯酰胺凝胶分析图。泳道1，dsDNA-1底物+CpG甲基转移酶+GlaI内切酶；泳道2，dsDNA-1底物+GlaI内切酶；泳道3，dsDNA-1底物+CpG甲基转移酶；泳道4，dsDNA-1底物。图2(B)为存在CpG甲基转移酶和不存在CpG甲基转移酶时605QD和Cy5荧光图谱。图3为在CpG甲基转移酶不存在(A-C)和存在(D-F)时，605QD和Cy5的单分子荧光成像。605量子点的荧光信号为绿色(A,D),Cy5的荧光信号为红色(B,E)。黄色荧光信号表明605QD和Cy5是共同存在的(C,F)。图4为Cy5强度随CpG甲基转移酶浓度的变化而变化图。图5为Cy5的个数随CpG甲基转移酶浓度的变化而变化图。插图表明Cy5的个数与CpG甲基转移酶的浓度呈对数线性相关。图6为测得Cy5的个数分别对应：CpG甲基转移酶，AluI甲基转移酶，HaeIII甲基转移酶，Dam甲基转移酶和仅含有反应缓冲溶液的对照组。图7为5-氮杂胞苷和5-氮杂胞苷-2-脱氧胞苷对CpG甲基转移酶活性的抑制作用图，其中，A为5-氮杂胞苷，B为5-氮杂胞苷-2-脱氧胞苷。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。如前所述，现有测CpG甲基转移酶普遍存在操作复杂、假阳性、灵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测甲基转移酶的单个量子点纳米传感器，其特征在于，所述纳米传感器至少包括：双链DNA探针，量子点和标记有荧光分子的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸；/n所述双链DNA探针设计有CpG甲基转移酶的识别位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测甲基转移酶的单个量子点纳米传感器，其特征在于，所述纳米传感器至少包括：双链DNA探针，量子点和标记有荧光分子的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸；
所述双链DNA探针设计有CpG甲基转移酶的识别位点。


2.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征在于，所述双链DNA探针5’末端上设计有生物素；3’末端设计有PO4；
优选的，所述双链DNA探针的碱基序列如下：
5’-biotin-GACTACTGTGCGmCTTCATGATC-PO4-3’(SEQIDNO.1)；
5’-biotin-GATCATGAAGmCGmCACAGTAGTC-PO4-3’(SEQIDNO.2)；
其中，mC为甲基胞嘧啶。


3.如权利要求1所述的的纳米传感器，其特征在于，所述量子点为605QDs，所述量子点表面包被有链亲和素。


4.如权利要求1所述的的纳米传感器，其特征在于，所述荧光分子为花菁5。


5.如权利要求1所述的的纳米传感器，其特征在于，所述纳米传感器还包括S-腺苷基甲硫氨酸、GlaI内切酶和末端转移酶。


6.权利要求1-5任一项所述纳米传感器在检测DNA甲基转移酶中的应用；所述DNA甲基转移酶为CpG甲基转移酶。


7.一种检测CpG甲基转移酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将待测样品和双链DNA探针进行甲基化反应得甲基化产物；
(2)将甲基化产...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，胡娟，刘杨，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37