一种石墨烯纳米孔测序仪及其测序方法技术

本发明专利技术涉及一种石墨烯纳米孔测序仪，包括探针纳米运动平台、AFM探针、纳米孔芯片、疏水液池以及三维纳米运动平台；所述AFM探针装夹在所述探针纳米运动平台上，所述疏水液池固定在所述三维纳米运动平台上，所述纳米孔芯片安装在所述疏水液池内；所述AFM探针的针尖设置有DNA四面体；所述纳米孔芯片上刻蚀有固态纳米孔且所述疏水液池内部的溶液通过所述纳米孔连通，所述纳米孔下方的溶液内设置有若干颗磁珠。本发明专利技术的石墨烯纳米孔测序仪能实现纳米孔精确寻址及单DNA分子可控过孔，用于降低DNA分子的过孔速度和抑制纳米孔中的DNA位移热运动，为实现单碱基测序提供新方法。

A graphene nanopore sequencer and its sequencing method

【技术实现步骤摘要】
一种石墨烯纳米孔测序仪及其测序方法
本专利技术涉及单分子控制领域及分子检测领域，具体涉及一种石墨烯纳米孔测序仪及其测序方法。
技术介绍
目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是OxfordNanoporeTechnologies(ONT)公司的MinION，GridION和PromethION三款不同类型测序仪器。ONT测序的特点是单分子测序，测序读长长，测序速度快，测序数据实时监控，机器便携等。2018年自然杂志上发表了许多里程碑式的纳米孔测序文章：直接RNA测序文章、首个纳米孔人类基因组测序文章，展示迄今为止使用单一测序技术完成的最完整的基因组。然而，以上实验大部分是使用ONT公司MinION检测得到的实验结果，而ONT公司仪器使用的都是生物纳米孔技术。生物纳米孔具有寿命短、抗化学、机械性能差等缺点。而固态纳米孔相对生物纳米孔在成本、使用寿命、机械性能等方面具有十分巨大的优势。然而，目前尚无课题组使用固态纳米孔完成测序工作。固态纳米孔测序面临的挑战主要有：一、时间分辨率，在电场的作用下，DNA过孔速度太快难以采集足够的有效数据点；二、空间分辨率，相邻碱基距离仅为0.34nm，要实现单碱基分辨率纳米孔厚度必需小于0.34nm，并且需要确保仅有单条DNA链通过纳米孔，防止其他DNA链对碱基数据信息采集的干扰，与此同时，需要帮助单条DNA链在其链长范围内找到纳米孔位置，使DNA链能够顺利穿过纳米孔，实现碱基信号采集。
技术实现思路
为了解决上述现有的固态纳米孔测序在时间分辨率以及空间分辨率所面临的难题，本专利技术提供了一种石墨烯纳米孔测序仪及其测序方法，实现纳米孔精确寻址及单DNA分子可控过孔，用于降低DNA分子的过孔速度和抑制纳米孔中的DNA位移热运动，为实现单碱基测序提供新方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案：一种石墨烯纳米孔测序仪，包括探针纳米运动平台、AFM探针、纳米孔芯片、疏水液池以及三维纳米运动平台；所述AFM探针装夹在所述探针纳米运动平台上，所述疏水液池固定在所述三维纳米运动平台上，所述纳米孔芯片安装在所述疏水液池内；所述AFM探针的针尖设置有DNA四面体；所述纳米孔芯片上刻蚀有固态纳米孔且所述疏水液池内部的溶液通过所述纳米孔连通，所述纳米孔下方的溶液内设置有若干颗磁珠。进一步的，所述探针纳米运动平台的纵向闭环行程大于25μm，其闭环分辨率小于0.3nm；所述三维纳米运动平台的三维方向闭环行程X/Y/Z均大于10μm，其闭环分辨率小于5nm，控制效果更好，控制精度更高。进一步的，所述AFM探针包括基体、金修饰层、金表面以及隔离层；所述金修饰层通过薄膜沉积技术包覆在所述基体的外侧表面，所述隔离层通过薄膜沉积技术包覆在所述金修饰层的外侧表面，所述金表面通过微纳加工制造技术刻蚀在所述AFM探针的尖端处并刻穿所述隔离层，所述金表面与所述DNA四面体相连，能够更好地进行测序。进一步的，所述DNA四面体的棱长为10bp～50bp，即3.4nm～17nm，DNA四面体用于捕获单条DNA链，这样的设计能够更好地进行测序。进一步的，所述金修饰层的厚度为30～100nm；所述隔离层的厚度为10～50nm；所述金表面的直径大于所述DNA四面体的棱长，能够更好地进行测序。进一步的，所述纳米孔芯片的材料为石墨烯或氮化硼或二硫化钼，所述纳米孔的直径小于5nm，测序更加精确。进一步的，所述疏水液池的材料为特氟龙，稳定性高。进一步的，所述磁珠为链霉亲和素磁珠，能够更好地进行测序。一种基于上述石墨烯纳米孔测序仪的纳米孔测序方法，包括以下步骤：S1、将处理好且未修饰的DNA四面体的AFM探针装夹在探针纳米运动平台上；S2、扫描实验区域精确定位纳米孔后固定AFM探针位置；S3、注入修饰溶液，使AFM探针的针尖依次组装与捕获DNA四面体和待测DNA，探针下行使DNA四面体上修饰链过孔，通过阻塞电流确定DNA四面体是否成功修饰，修饰成功后再绑定待测DNA；S4、在纳米孔芯片上下方注入测试液，并在纳米孔芯片下方布置链霉亲和素磁珠；S5、在纳米孔两侧施加电压驱动AFM探针尖端表面待测DNA穿过纳米孔，并被下方磁珠表面链霉亲和素所捕获，在电场力的作用下，将待测DNA拉直；S6、通过控制探针纳米运动平台，实现AFM探针垂直向下移动，实现DNA测序。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、纳米孔位置实现精确定位，本专利技术中可利用原子力显微镜原理对纳米孔位置进行精确寻址，保证了DNA通过纳米孔的前提条件；2、单分子限位亚纳米操控与测序分辨率高，单个DNA四面体、磁珠、单链DNA分子和AFM探针的可控精确组装，解决了传统纳米孔测序遇到的时间分辨率低的问题，同时，采用高精密速度控制的纳米定位技术实现DNA在纳米孔内运动的主动控制，控制了单碱基穿过纳米孔的速率，提高纳米孔测序遇到的信号的精确度。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据附图获得其他的附图。图1为本专利技术一种石墨烯纳米孔测序仪的结构示意图；图2为本专利技术中的AFM探针结构示意图；图3为本专利技术一种石墨烯纳米孔测序方法原理示意图；图4为本专利技术一种石墨烯纳米孔测序方法步骤流程图；图5为本专利技术一种石墨烯纳米孔测序方法步骤示意图。图中：1探针纳米运动平台2AFM探针20探针基体21金修饰层210金表面22隔离层23DNA四面体3纳米孔芯片30纳米孔4疏水液池5三维纳米运动平台6待测DNA7磁珠具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例包括：实施例一：如图1-3所示，一种石墨烯纳米孔测序仪，包括探针纳米运动平台1、AFM探针2、纳米孔芯片3、疏水液池4以及三维纳米运动平台5；AFM探针2装夹在探针纳米运动平台1上，疏水液池4固定在三维纳米运动平台5上，纳米孔芯片3安装在疏水液池4内；AFM探针2的针尖设置有DNA四面体23；纳米孔芯片3上刻蚀有固态纳米孔30且疏水液池4内部的溶液通过纳米孔30连通，纳米孔30下方的溶液内设置有若干颗磁珠7。在本实施例中，探针纳米运动平台1的纵向闭环行程大于25μm，其闭环分辨率小于0.3nm；三维纳米运动平台5的三维方向闭环行程X/Y/Z均大于10μm，其闭环分辨率小于5nm，控制效果更好，控制精本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种石墨烯纳米孔测序仪，其特征在于，包括探针纳米运动平台、AFM探针、纳米孔芯片、疏水液池以及三维纳米运动平台；所述AFM探针装夹在所述探针纳米运动平台上，所述疏水液池固定在所述三维纳米运动平台上，所述纳米孔芯片安装在所述疏水液池内；所述AFM探针的针尖设置有DNA四面体；所述纳米孔芯片上刻蚀有固态纳米孔且所述疏水液池内部的溶液通过所述纳米孔连通，所述纳米孔下方的溶液内设置有若干颗磁珠。/n

【技术特征摘要】
1.一种石墨烯纳米孔测序仪，其特征在于，包括探针纳米运动平台、AFM探针、纳米孔芯片、疏水液池以及三维纳米运动平台；所述AFM探针装夹在所述探针纳米运动平台上，所述疏水液池固定在所述三维纳米运动平台上，所述纳米孔芯片安装在所述疏水液池内；所述AFM探针的针尖设置有DNA四面体；所述纳米孔芯片上刻蚀有固态纳米孔且所述疏水液池内部的溶液通过所述纳米孔连通，所述纳米孔下方的溶液内设置有若干颗磁珠。


2.根据权利要求1所述的石墨烯纳米孔测序仪，其特征在于，所述探针纳米运动平台的纵向闭环行程大于25μm，其闭环分辨率小于0.3nm；所述三维纳米运动平台的三维方向闭环行程X/Y/Z均大于10μm，其闭环分辨率小于5nm。


3.根据权利要求2所述的石墨烯纳米孔测序仪，其特征在于，所述AFM探针包括基体、金修饰层、金表面以及隔离层；所述金修饰层通过薄膜沉积技术包覆在所述基体的外侧表面，所述隔离层通过薄膜沉积技术包覆在所述金修饰层的外侧表面，所述金表面通过微纳加工制造技术刻蚀在所述AFM探针的尖端处并刻穿所述隔离层，所述金表面与所述DNA四面体相连。


4.根据权利要求3所述的石墨烯纳米孔测序仪，其特征在于，所述DNA四面体的棱长为10bp～50bp，即3.4nm～17nm。


5.根据权利要求4所述的石墨烯纳米孔测序仪，其特征在于，所述金修饰层的厚...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁志山，刘佑明，王成勇，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44