一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15及其应用，涉及基因工程技术领域，所述转录因子AaTCP15的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术提供的青蒿TCP类转录因子AaTCP15，能够激活青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子，正向调控DBR2和ALDH1基因的表达，从而促进青蒿素的生物合成；并利用转基因技术将青蒿转录因子AaTCP15的过量表达载体或反义干扰载体转化青蒿，实现了对植株中青蒿素含量增高或降低的调控。本发明专利技术提供的转录因子AaTCP15及其应用对于青蒿中青蒿素含量的提高及青蒿的品质改良、培育高含量青蒿素新品种、青蒿素的规模化生产具有重要意义。

A TCP transcription factor aatcp15 from Artemisia annua and its application

【技术实现步骤摘要】
一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15及其应用。
技术介绍
青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属一年生草本植物，是我国重要的传统中药，具有清热解毒、截疟、祛暑和除蒸的功效。青蒿素是从青蒿中提取出来的倍半烯萜内酯类化合物，因其对疟疾有很好的治疗作用而闻名全球。基于青蒿素的联合治疗方法(ACT)是世界卫生组织(WHO)推荐的首选疗法。除了治疗疟疾以外，青蒿素及其衍生物对于治疗红斑狼疮相关肾炎、病毒感染、血吸虫病、肺结核以及糖尿病都有一定的效果，可见青蒿素类化合物作为广谱天然药物具有十分广阔的研究和应用前景。在植物中，青蒿素的主要来源是从青蒿中提取，但是青蒿素的含量在青蒿中很低，只占青蒿叶片干重的0.01％-1.0％。因此，如何提高青蒿中青蒿素的含量是青蒿产业化中的一个重大问题。目前有多种策略可以提高青蒿中青蒿素的含量，包括过表达青蒿素合成关键酶基因、阻断青蒿素合成竞争支路、青蒿素转运蛋白的调控和青蒿素生物合成基因的转录调控。其中，转录因子能激活植物次生代谢产物合成途径中多个合成酶基因的协同表达而有效促进次生代谢产物的合成，因此对青蒿素生物合成基因的转录调控研究逐渐成为国内外关注的焦点。TCP类转录因子最早发现于淡水植物轮藻，是一类植物特有的转录因子。TCP类转录因子包含59个氨基酸组成的非典型碱性螺旋-环-螺旋结构域，即TCP结构域，这个结构域主要负责与DNA结合以及蛋白互作。植物中，根据TCP蛋白DNA结合结构域(TCP结构域)的不同将TCP类转录因子分为两个主要的家族，即classITCPs和classIITCPs。TCP15属于classITCPs，参与植物的生长发育、次生代谢调控和对激素的响应。目前，关于TCP类转录因子在植物次生代谢调控中的功能和作用机制研究还较少，仅有的研究也多数集中在模式植物拟南芥中。拟南芥的研究工作表明TCP类转录因子参与调控花青素、叶绿素和类胡萝卜素的生物合成，然而青蒿中TCP类转录因子的功能还报道较少，它们在青蒿素生物合成中的功能和作用机制还有待进一步发掘。因此，本领域的技术人员致力于开发一种可以调控促进青蒿素合成的TCP类转录因子，并通过建立该转录因子的过表达载体以及转化植株，培育得到青蒿素合成量提高的转基因植株，为青蒿的品质改良、培育高含量青蒿素新品种、青蒿素的规模化生产提供重要的基础和支持。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何开发一种可以调控促进青蒿素合成的TCP类转录因子，并通过建立该转录因子的过表达载体以及转化植株，培育得到青蒿素合成量提高的转基因植株，为青蒿的品质改良、培育高含量青蒿素新品种、青蒿素的规模化生产提供重要的基础和支持。为实现上述目的，本专利技术提供了一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15，所述转录因子AaTCP15的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。进一步地，所述转录因子AaTCP15的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提供了一种包含如上所述的转录因子AaTCP15的编码基因核苷酸序列的重组表达载体。本专利技术还提供了一种包含如上所述的转录因子AaTCP15的氨基酸序列的重组表达转化体。本专利技术还提供了一种如上所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用，其特征在于，所述应用通过所述转录因子AaTCP15激活青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子表达来实现，具体包括以下步骤：步骤一、将所述转录因子AaTCP15的编码基因的核苷酸序列连接于植物表达调控序列上，构建含有所述转录因子AaTCP15的编码基因的植物过量表达载体；步骤二、将所述青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子ProDBR2和ProALDH1分别连入载体pGreenII0800-LUC，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1；步骤三、将所述植物过量表达载体和所述植物双荧光素检测报告载体分别转入宿主菌株农杆菌GV3101中，获得含有表达载体的工程菌株；步骤四、将含有所述植物过量表达载体的所述工程菌株分别与含有所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1的所述工程菌株混合后，注射到植株中，并检测荧光强度，确定所述转录因子AaTCP15对所述青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子的激活作用；步骤五、将所述转录因子AaTCP15的编码基因的核苷酸序列连接于植物表达调控序列上，构建含有所述转录因子AaTCP15的编码基因的反向互补序列的反义干扰载体；步骤六、将所述步骤一的所述植物过量表达载体与所述步骤六的所述反义干扰载体转入宿主菌株农杆菌EHA105中，分别获得含有所述植物过量表达载体和所述反义干扰载体的工程菌株，并转入青蒿植株中；步骤七，筛选获得含有转录因子AaTCP15的转化细胞，并再生转基因植株，得到青蒿素含量显著提高的过量表达转基因植株和青蒿素含量显著降低的反义干扰表达转基因植株。进一步地，所述步骤三和所述步骤六中的所述转入所述宿主菌株的方法采用冻融法。进一步地，所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1转入的所述宿主菌株为带有pSoup19辅助质粒的农杆菌GV3101菌株。进一步地，所述步骤四中的含有所述植物过量表达载体的所述工程菌株与含有所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1的所述工程菌株按1：1混合。进一步地，所述步骤七中采用抗生素筛选所述转化细胞，优选的，所述抗生素选用卡那霉素。本专利技术还提供了一种如上所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15在培育青蒿素含量提高的转基因青蒿植株中的应用。与现有技术相比，本专利技术至少具备以下有益的技术效果：(1)本专利技术提供的转录因子AaTCP15，对青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子具有明显的激活作用，能够显著提高植株中青蒿素的含量；(2)本专利技术构建了青蒿转录因子AaTCP15的过量表达载体和反义干扰载体，实现了对青蒿素含量的增高或降低的调控；(3)本专利技术实现了转录因子AaTCP15的过量表达载体的构建及青蒿素含量提高的转基因青蒿植株的培育，对青蒿品种的改良、青蒿素的规模化生产具有重要意义。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是本专利技术的一个较佳实施例的AaTCP15转录因子在青蒿中调控青蒿素表达量结果统计图，其中，A为AaTCP15过量表达载体青蒿中青蒿素的含量，B本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15，其特征在于，所述转录因子AaTCP15的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15，其特征在于，所述转录因子AaTCP15的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。


2.如权利要求1所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15，其特征在于，所述转录因子AaTCP15的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


3.一种包含如权利要求2所述的转录因子AaTCP15的编码基因核苷酸序列的重组表达载体。


4.一种包含如权利要求1所述的转录因子AaTCP15的氨基酸序列的重组表达转化体。


5.一种如权利要求1或2所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用，其特征在于，所述应用通过所述转录因子AaTCP15激活青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子表达来实现，具体包括以下步骤：
步骤一、将所述转录因子AaTCP15的编码基因的核苷酸序列连接于植物表达调控序列上，构建含有所述转录因子AaTCP15的编码基因的植物过量表达载体；
步骤二、将所述青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子ProDBR2和ProALDH1分别连入载体pGreenII0800-LUC，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1；
步骤三、将所述植物过量表达载体和所述植物双荧光素检测报告载体分别转入宿主菌株农杆菌GV3101中，获得含有表达载体的工程菌株；
步骤四、将含有所述植物过量表达载体的所述工程菌株分别与含有所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1的所述工程菌株混合后，注射到植株中，并检测荧光强度，确定所述转录因子AaTCP15对所述青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子的激活作用；
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【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，严欣，吴张宽玉，马亚男，付雪晴，黎凌，苗志奇，张耀杰，刘航，陈甜甜，李勇鹏，秦维，钱虹妹，孙小芬，谢利辉，王宇婷，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31