猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法。本发明专利技术采用细胞连续传代的方法及细胞悬浮培养技术提供了一种免疫保护率高、稳定性好、产量高、安全可靠的用于紧急预防接种的猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗，为PEDV和PDCoV的防控提供有效手段。

Swine epidemic diarrhea, swine delta coronavirus bivalent attenuated vaccine and its preparation

【技术实现步骤摘要】
猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法
本专利技术涉及生物技术和预防兽医领域，具体地说，涉及一种猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)属于尼多目、冠状病毒属，病毒核酸是具有感染性的线性单股正链无节段RNA。猪流行性腹泻病毒(PEDV)是猪病毒性腹泻爆发的主要病原之一。猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus,PDCoV)属于尼多目、冠状病毒科、冠状病毒亚科δ冠状病毒属成员，病毒核酸为单股正链无节段RNA。PDCoV是2012年新发现的一种感染猪的新型肠道冠状病毒，可感染不同日龄的猪只并表现出腹泻、呕吐、脱水等临床症状，发病仔猪中的死亡率为30％～40％。该病于2014年在美国猪场爆发，同年在我国内陆爆发，随后几年在世界范围内蔓延，给养猪业带来了巨大的经济损失。目前针对PDCoV已经建立了一系列检测方法，检测结果显示PDCoV既存在单独感染，也存在与其它猪肠道冠状病毒混合感染的情况，然而当前针对PDCoV致病机制的研究较少，对该病的认识不够全面，缺少商品化疫苗，仍缺少有效的疫苗防控该病的发生。PEDV和PDCoV均属于冠状病毒科病毒，抗原形态相似，这两种病毒引起的疾病在流行病学和病理剖检上也极其相似，但是彼此又没有共同的抗原性，在免疫学和血清学上相互没有交叉反应。由此可见，同时防控两种疾病显得尤为重要。目前因PEDV、PDCoV等混合感染而引起的疾病是全球养猪业面临的一大难题，国内尚无PEDV和PDCoV二联弱毒疫苗的相关研究。弱毒疫苗具有免疫途径多、免疫剂量小、免疫持续时间长、无需佐剂以及免疫动物体后，免疫细胞能够很快到达呼吸道黏膜和消化道黏膜与病原发生相应作用而起到免疫保护作用，拒绝病原的继续感染和侵害，同时，其免疫调节作用对病原也起到杀灭作用等优点。因此研制一种免疫效果好、安全可靠的猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联细胞弱毒疫苗，对于阳性猪场净化以及国内PEDV和PDCoV的防控具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种免疫效果好、安全可靠的猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株，其为猪流行性腹泻病毒细胞传代致弱毒，该毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCCNO:V202007，保藏日期2019年12月19日。第二方面，本专利技术提供一种猪德尔塔冠状病毒KQ2018F120株，其为猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒，该毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCCNO:V202008，保藏日期2019年12月19日。其中，猪流行性腹泻病毒细胞传代致弱毒种毒分离于湖北某猪场，其病变图和PCR鉴定图如图1所示，PCR引物针对PEDVS蛋白基因，目的片段为651bp，上游引物为PEDV-F：5'-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3'，下游引物序列为PEDV-R：5'-CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3'。在分离得到猪流行性腹泻病毒后，经贴壁vero细胞传代120代即为所述猪流行性腹泻病毒细胞传代致弱毒。猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒种毒分离于河南某猪场，其病变图和PCR鉴定图如图2所示，PCR引物针对PDCoVN蛋白基因，目的片段为329bp，上游引物为PDCoV-F：5'-CCAAACGCAACCCCAACAATCC-3'，下游引物序列为PDCoV-R：5'-CTTCTCAGTGTCTGCAGAGCCG-3'。在分离得到猪流行性腹泻病毒后，经贴壁ST细胞传代120代即为所述猪德尔塔冠状病毒细胞传代致弱毒。第三方面，本专利技术提供所述猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株和/或所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018F120株在疫苗制备中的应用。第四方面，本专利技术提供一种组合物，其包含所述猪流行性腹泻病毒和/或所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018F120株以及药学上可接受的载体。第五方面，本专利技术提供一种猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗，所述二联弱毒疫苗是将所述猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株、所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018F120株分别接种至易感细胞(如ST细胞)进行培养，收获的病毒液按比例混合后，加入冻干保护剂混匀，然后冷冻干燥得到的。收获的猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株的病毒液、猪德尔塔冠状病毒KQ2018F120株的病毒液病毒滴度均不低于106TCID50/0.1mL。优选地，两种病毒液按等体积混合。优选地，所述冻干保护剂为明胶和蔗糖。更优选地，冻干保护剂由明胶和蔗糖加水配制而成，其中明胶8g/L，蔗糖48g/L。将冻干保护剂按体积比1：7的比例加入PEDV和PDCoV的病毒混合液中。第六方面，本专利技术提供所述二联弱毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)在生物反应器中悬浮培养ST细胞，用猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株、猪德尔塔冠状病毒KQ2018F120株分别接种培养好的ST细胞，继续培养，待细胞病变达80％以上时收获病毒，取自然沉淀的病毒上清液，过滤后浓缩，作为制苗用病毒液；2)收获的病毒液按比例混合后，加入冻干保护剂混匀，进行冷冻干燥。前述的方法，细胞培养条件为：37℃，pH7.2，DO(溶氧)值50％，转速75rpm。本专利技术中，用于悬浮培养ST细胞的培养基为含100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的MEM培养基。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：(一)本专利技术选用流行毒株的细胞传代致弱毒来制备疫苗，保证了疫苗的高免疫保护力。(二)本专利技术制备的弱毒株稳定性好，PEDV和PDCoV弱毒株经克隆纯化后都保持了良好的稳定性，克隆纯化选取1mm以内的小空斑，在制备二联弱毒苗时，对种毒进行3次噬斑直径和形态特点的检测，保持了小空斑的特点。(三)本专利技术提供的弱毒株安全性高，制备的猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒二联细胞弱毒疫苗无毒力返强现象。(四)本专利技术选用悬浮ST细胞制备制苗用病毒液，为高效率生产疫苗提供了保障。(五)本专利技术为临床上针对猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒病的防控以及猪流行性腹泻病毒和猪德尔塔冠状病毒在猪群中的清除提供物质基础和技术支撑，具有广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术猪流行性腹泻病毒接种到Vero细胞上的病变图片和病毒分离株PCR检测结果。图中，A为未接种的空白细胞对照；B为接种后的细胞病变；C为猪流行性腹泻病毒分离株PCR检测结果，图中，M：DNAMarkerDL2000；1：样品；2：阴性对照。图2为本专利技术猪德尔塔冠状病毒接种到ST细胞上的病变图片和病毒分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪流行性腹泻病毒KQ2018 F120株，其特征在于，保藏号为CCTCC NO:V202007。/n

【技术特征摘要】
1.猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株，其特征在于，保藏号为CCTCCNO:V202007。


2.猪德尔塔冠状病毒KQ2018F120株，其特征在于，保藏号为CCTCCNO:V202008。


3.权利要求1所述猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株和/或权利要求2所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018F120株在疫苗制备中的应用。


4.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株和/或权利要求2所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018F120株以及药学上可接受的载体。


5.猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗，其特征在于，所述二联弱毒疫苗是将权利要求1所述猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株、权利要求2所述猪德尔塔冠状病毒KQ2018F120株分别接种至易感细胞进行培养，收获的病毒液按比例混合后，加入冻干保护剂混匀，然后冷冻干燥得到的。


6.根据权利要求5所述的二联弱毒疫苗，其特征在于，收获的猪流行性腹泻病毒KQ2018F120株的病毒液、猪德尔塔冠状病毒KQ2...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐高原，周明光，张华伟，陈波，郝根喜，金建云，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42