一种杆菌肽及其组分的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种新的杆菌肽(Bacitracin)组分及其高效液相色谱‑质谱(HPLC‑MS)分析方法。该组分经HPLC‑MS及二级质谱分析验证为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y，这种新型的组分被命名为杆菌肽HZ(bacitracin HZ)。本发明专利技术揭示存在新的非蛋白质氨基酸，如2‑氨基‑3‑乙烯基‑5‑己烯酸、2‑氨基‑4‑乙烯基‑5‑己烯酸、3‑乙烯基半胱氨酸、2‑乙烯基半胱氨酸。杆菌肽HZ具有不同于常见杆菌肽组分的抗菌活性或毒性，有潜在的应用价值，并且该类化合物的结构确证也为严格控制杆菌肽的质量提供了研究基础。

A method for the analysis of bacitracin and its components

【技术实现步骤摘要】
一种杆菌肽及其组分的分析方法技术背景本专利技术涉及药物分析化学领域，具体而言，涉及一种杆菌肽及其组分的分析方法。
技术介绍
杆菌肽(结构式结合图1和表1)是由枯草杆菌和地衣芽孢杆菌产生的多组分抗菌肽，能强烈抑制革兰氏阳性菌，主要用于治疗耐青霉素的葡萄球菌感染。杆菌肽具有特殊的抑菌机理，会干扰细菌细胞壁的合成，同时在肽聚糖的合成中抑制磷脂受体的再生，使得其具有抗菌谱广、不易产生耐药性等特性。在药用过程中添加锌离子以增强活性。表1杆菌肽结构通式A和B的Rn的表达式由于是发酵产品，杆菌肽组分较多，在《美国药典》40版中收录了杆菌肽A、B、C、F等组分，《欧洲药典》9.6版中收录了19种组分或有关物质，另外还有其他未知组分。而《美国药典》40版、《欧洲药典》9.6版采用的高效液相色谱法(磷酸氢二钾/乙腈/甲醇体系)选择非挥发性流动相体系，不适合直接进行质谱分析，无法实现在线确定未知组分的结构。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术中公布了一种杆菌肽及其组分的分析方法，该方法为高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析方法。经一级质谱及二级质谱分析验证这种杆菌肽为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y，命名为杆菌肽HZ(bacitracinHZ)。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案包括：本专利技术的第一方面是提供一种新的杆菌肽，命名为杆菌肽HZ(bacitracinHZ)。该种杆菌肽的组分为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y。进一步地，亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的组成单元包括1位异亮氨酸、2位半胱氨酸、3位亮氨酸、4位谷氨酸、5位异亮氨酸、6位赖氨酸、7位鸟氨酸、8位异亮氨酸、9位苯丙氨酸、10位组氨酸、11位天冬氨酸、12位天冬酰胺，1位异亮氨酸与2位半胱氨酸形成噻唑啉环，6至12位氨基酸形成环7肽；双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A是指原杆菌肽A的1位异亮氨酸处的β’-甲基及γ’-甲基发生亚甲基化，2位半胱氨酸处的β”位发生乙烯基化，其结构如下：或原杆菌肽A的1位异亮氨酸处的β’-甲基及γ’-甲基发生亚甲基化，2位半胱氨酸处的α”位发生乙烯基化，其结构如下：进一步地，所述双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的组成单元包括1位异亮氨酸、2位半胱氨酸、3位亮氨酸、4位谷氨酸、5位异亮氨酸、6位赖氨酸、7位鸟氨酸、8位异亮氨酸、9位苯丙氨酸、10位组氨酸、11位天冬氨酸、12位天冬酰胺，1位异亮氨酸与2位半胱氨酸形成噻唑环，6至12位氨基酸形成环7肽；双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y是指原杆菌肽Y的1位异亮氨酸处的β’-甲基及γ’-甲基发生亚甲基化，2位半胱氨酸处的β”位发生乙基化，其结构如下：进一步地，双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A，β’及α”、β”-碳的构型是R构型或S构型。进一步地，双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的组成氨基酸是L型或D型。进一步地，双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的β’-碳的构型是R构型或S构型。进一步地，双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的组成氨基酸是L型或D型。进一步地，杆菌肽HZ的1位、5位或8位的异亮氨酸可转化为亮氨酸，转化后形成的组分发生双亚甲基化或不发生双亚甲基化。进一步地，双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学结构式A-I和双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学结构式Y-I分别如下所示：本专利技术的第二方面提供存在于杆菌肽HZ新的非天然蛋白质氨基酸：2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸A、2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸B、3-乙烯基半胱氨酸C、2-乙烯基半胱氨酸D，结构式如下：进一步地，杆菌肽包括杆菌肽HZ的氧化产物、差向异构化产物、水解产物、硫酸化产物、磺酸化产物等，或者其他杆菌肽产物。本专利技术的第三方面是提供包括杆菌肽HZ的杆菌肽原料药或杆菌肽锌原料药或药物组合。本专利技术的第四方面是提供包括上述原料药或药物组合物的药物制剂为注射剂、软膏剂或眼膏。本专利技术的第五方面是提供获得杆菌肽的组分及其结构的方法为高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析方法。进一步地，MS离子化方式可以选择电喷雾离子化、大气压离子化等，优选为电喷雾离子化。进一步地，MS的质量分析器可以选择四级杆飞行时间质谱、线性或三维离子肼质谱、三重四级杆质谱、轨道离子肼质谱等，优选为四级杆飞行时间质谱。进一步地，杆菌肽HZ及其他杆菌肽组分可以通过一级质谱及二级质谱的信息进行结构判断。进一步地，MS及MS/MS扫描范围为50-2000amu。进一步地，二级质谱碰撞能量设置范围为10-30eV，优选为20eV、30eV。进一步地，测得的杆菌肽HZ的分子量为736.8908([M+2H]2+)，二级质谱的特征离子为m/z604.32、491.23、382.14、362.19、334.19、253.10、249.11和110.07。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术首次发现杆菌肽HZ，即双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y，可能具有不同于常见杆菌肽组分的抗菌活性或毒性，有潜在的应用价值，并且该类化合物的结构确证也为严格控制杆菌肽的质量提供了研究基础；(2)本专利技术首次通过MS及MS/MS数据鉴定了双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的结构；(3)本专利技术揭示存在新的非天然蛋白质氨基酸，如2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸、2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸、3-乙烯基半胱氨酸、2-乙烯基半胱氨酸；(4)本专利技术中的HPLC-MS/MS方法可用于直接分析杆菌肽中的其他组分的结构，即综合采用一级质谱获得分子量、二级质谱碎片离子及氨基酸残基离子推测组分结构，该解析策略也可推广至其他多肽类抗生素的结构解析中。附图说明图1为本专利技术
技术介绍
中杆菌肽组分的结构通式；图2为本专利技术一实施例中杆菌肽供试品的质谱总离子流图；图3为本专利技术一实施例中杆菌肽HZ的一级质谱图；图4为本专利技术一实施例中杆菌肽HZ的二级质谱图；图5为本专利技术一实施例中杆菌肽A的裂解规律图；图6为本专利技术一实施例中杆菌肽HZ：双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的化学结构式；图7为本专利技术一实施例中杆菌肽HZ：双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的化学结构式；图8为本专利技术一实施例中杆菌肽HZ：双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A-I(1位异亮氨酸被亮氨酸取代)的化学结构式；图9本专利技术一实施例中为杆菌肽HZ：双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y-I(1位异亮氨酸被亮氨酸取代)的化学结构式；图10本专利技术一实施例中为新的非天然蛋白质氨基酸的化学结构式；其中，A：2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸、B：2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸、C：3-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杆菌肽，其特征在于，所述杆菌肽为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A(式Ⅰ或式Ⅱ)或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y(式Ⅲ)：/n

【技术特征摘要】
1.一种杆菌肽，其特征在于，所述杆菌肽为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A(式Ⅰ或式Ⅱ)或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y(式Ⅲ)：





2.根据权利要求1所述的杆菌肽，其特征在于，所述的杆菌肽1位、5位或8位的异亮氨酸可转化为亮氨酸，转化后形成的组分发生双亚甲基化或不发生双亚甲基化；
其中，双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学结构式A-I和双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学结构式Y-I分别如下所示：





3.根据权利要求2所述的杆菌肽，其特征在于，所述的杆菌肽存在新的非蛋白质氨基酸：2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸A、2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸B、3-乙烯基半胱氨酸C、2-乙烯基半胱氨酸D，结构式如下：





4.根据权利要求1的一种新的杆菌肽，其特征在于，所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张含智，刘浩，赵敬丹，秦峰，闻宏亮，裘亚，
申请(专利权)人：上海市食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：上海;31