【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改变微生物群体和修饰微生物群专利
本专利技术涉及指导的核酸酶、CRISPR/Cas系统、crRNA、单一gRNA、载体、方法和药物组合物,例如用于靶向孢子形成细菌或用于靶向艰难梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌或链球菌。专利技术背景抑制细菌群体生长和改变混合物中的不同细菌物种的相对比例发现应用于广泛的工业和背景中,例如用于处理水道、饮用水或在其他环境背景中。还发现应用于在人和非人动物(例如牲畜)中改变细菌,用于减少致病性感染或重新平衡肠道或口腔微生物群。最近,有兴趣分析人肠道细菌在具有不同体重或肥胖情况的人中的相对比例,或者研究疾病背景诸如克罗恩病中可能的细菌影响。虽然细菌针对噬菌体的先天性免疫机制很多,一种广泛记录的细菌适应性免疫系统为CRISPR/Cas系统。工程改造的CRISPR/Cas系统已用于精确修饰从细菌至动物和植物细胞范围内各种类型的原核和真核细胞中的核酸(例如参见JiangW等人(2013))。原核生物(诸如细菌和古细菌)编码适应性免疫系统,称为CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关的),以提供针对移动的入侵者、诸如病毒(例如细菌噬菌体)和质粒的抗性。参考Seed等人(2013),其解释细菌噬菌体(或噬菌体)是地球上最丰富的生物实体,并估计数目超过其细菌猎物的10倍。噬菌体捕食的不断威胁已导致广泛范围的细菌免疫机制的进化,这进而导致不同的噬菌体免疫逃避策略的进化,导致动态的共进化军备竞赛。宿主免疫是基于入侵者DNA序列在记忆位点(CRISPR阵列)中的结合、从 ...
【技术保护点】
1.用于杀死宿主细胞或减少宿主细胞的生长的宿主修饰(HM)-CR1SPR/Cas系统,其中所述宿主细胞是梭菌细胞,所述系统包含/n(a) 用于在宿主细胞中表达HM-crRNA的编码所述HM-crRNA的工程改造的核酸序列,其中各crRNA可与相应的宿主细胞中的Cas3和CASCADE (用于抗病毒防御的CRISPR-相关复合物) Cas一起操作,其中所述工程改造的核酸序列包含/n(i) 一个或多个重复序列;和/n(ii) 编码所述HM-crRNA的序列的间隔区序列,其中所述HM-crRNA序列能够与宿主细胞靶标核苷酸序列杂交以将Cas指导至宿主细胞中的靶标序列,其中所述靶标序列在包含CCW、CCA、CCT、CCC、CCG或TCA或由其组成的PAM的紧邻3’;/n(b) CASCADE Cas;和/n(c) Cas3或用于在宿主细胞中表达Cas3的编码Cas3的核苷酸序列,或其直向同源物或同源物;/n其中表达的HM-crRNA能够在宿主细胞中与CASCADE Cas和Cas3或所述直向同源物或同源物组合,其中所述Cas3、直向同源物或同源物可与宿主细胞中的所述HM-crRNA一起操作以修 ...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170625 GB 1710126.2;20170716 GB 1711406.71.用于杀死宿主细胞或减少宿主细胞的生长的宿主修饰(HM)-CR1SPR/Cas系统,其中所述宿主细胞是梭菌细胞,所述系统包含
(a)用于在宿主细胞中表达HM-crRNA的编码所述HM-crRNA的工程改造的核酸序列,其中各crRNA可与相应的宿主细胞中的Cas3和CASCADE(用于抗病毒防御的CRISPR-相关复合物)Cas一起操作,其中所述工程改造的核酸序列包含
(i)一个或多个重复序列;和
(ii)编码所述HM-crRNA的序列的间隔区序列,其中所述HM-crRNA序列能够与宿主细胞靶标核苷酸序列杂交以将Cas指导至宿主细胞中的靶标序列,其中所述靶标序列在包含CCW、CCA、CCT、CCC、CCG或TCA或由其组成的PAM的紧邻3’;
(b)CASCADECas;和
(c)Cas3或用于在宿主细胞中表达Cas3的编码Cas3的核苷酸序列,或其直向同源物或同源物;
其中表达的HM-crRNA能够在宿主细胞中与CASCADECas和Cas3或所述直向同源物或同源物组合,其中所述Cas3、直向同源物或同源物可与宿主细胞中的所述HM-crRNA一起操作以修饰靶标序列,由此可以杀死宿主细胞或可以减少宿主细胞群体生长。
2.用于权利要求1的系统中的工程改造的核苷酸序列,其中所述工程改造的序列编码HM-crRNA,用于在宿主细胞中表达所述HM-crRNA,其中各crRNA可与相应的宿主细胞中的Cas3和CASCADECas一起操作,且其中所述工程改造的核酸序列包含
(i)一个或多个重复序列;和
(ii)编码所述HM-crRNA的序列的间隔区序列,其中所述HM-crRNA序列能够与宿主细胞靶标核苷酸序列杂交以将Cas指导至宿主细胞中的靶标序列,其中所述靶标序列在包含CCW、CCA、CCT、CCC、CCG或TCA或由其组成的PAM的紧邻3’。
3.任一前述权利要求的系统或工程改造的序列,其中所述Cas3包含选自SEQIDNO:275-286和273的氨基酸序列或与所述选择的序列具有至少70%同一性的序列。
4.任一前述权利要求的系统或工程改造的序列,其中(i)的重复序列是选自SEQIDNO:290-513和138-209的重复序列;或与所述选择的序列具有至少70%同一性的序列。
5.权利要求4的系统或工程改造的序列,其中所述重复序列是选自以下的重复序列:
(a)SEQIDNO:138-146和496-513,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌R20291菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(b)SEQIDNO:147-158、290-306和370-384,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌630菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(c)SEQIDNO:159-166,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌ATCC45233菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(d)SEQIDNO:167-175,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌Bi-9菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(e)SEQIDNO:176-181和470-476,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌M120菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(f)SEQIDNO:182-187,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌CF5菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(g)SEQIDNO:188-194,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌CD002菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(h)SEQIDNO:195-201,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌CD3菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(i)SEQIDNO:202-209,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌CD69菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(j)SEQIDNO:351-369,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌2007855菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(k)SEQIDNO:385-419,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌BI1菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(l)SEQIDNO:420-434,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌BI9菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;或
(m)SEQIDNO:435-452,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌CD196菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(n)SEQIDNO:420-434,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌BI9菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(o)SEQIDNO:453-468,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌CF5菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;或
(p)SEQIDNO:477-495,任选地其中所述宿主细胞是艰难梭菌M68菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3。
6.任一前述权利要求的系统或工程改造的序列,其中所述靶标核苷酸序列由选自SEQIDNO:220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259和260的序列包含。
7.权利要求1至5中任一项的系统或工程改造的序列,其中所述靶标核苷酸序列由基因包含,所述基因由宿主细胞中的σ因子介导的基因表达级联包含。
8.任一前述权利要求的系统或工程改造的序列,其中所述靶标序列的转录在宿主细胞物种的细胞中通过如下控制:
(a)σE;
(b)σF;
(c)σG;
(d)σH;
(e)σK;
(f)Spo0A;
(g)SpoIIID;
(h)SpoVT;或
(i)SpoIIR。
9.任一前述权利要求的系统或工程改造的序列,其中所述靶标核苷酸序列由基因包含,所述基因编码在宿主细胞物种中直接或间接地控制σ因子的转录的产物。
10.任一前述权利要求的系统或工程改造的序列,其中所述靶标核苷酸序列由选自表12至17和23中所述的基因的基因或其同源物、直向同源物或功能等效物包含。
11.任一前述权利要求的系统或工程改造的序列,其中所述靶标序列由I、II、III、IV或V期孢子形成基因包含,或编码孢子衣壳蛋白。
12.用于杀死宿主细胞或减少宿主细胞的生长的HM-CRlSPR/Cas系统,其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞,所述系统包含
(a)用于在宿主细胞中表达HM-crRNA的编码所述HM-crRNA的工程改造的核酸序列,其中各crRNA可与相应的宿主细胞中的Cas3和CASCADECas一起操作,其中所述工程改造的核酸序列包含
(i)一个或多个重复序列;和
(ii)编码所述HM-crRNA的序列的间隔区序列,其中所述HM-crRNA序列能够与宿主细胞靶标核苷酸序列杂交以将Cas指导至宿主细胞中的靶标序列,其中所述靶标序列在包含AWG或由其组成的PAM的紧邻3’;
(b)CASCADECas;和
(c)Cas3或用于在宿主细胞中表达Cas3的编码Cas3的核苷酸序列,或其直向同源物或同源物;
其中表达的HM-crRNA能够在宿主细胞中与CASCADECas和Cas3或所述直向同源物或同源物组合,其中所述Cas3、直向同源物或同源物可与宿主细胞中的所述HM-crRNA一起操作以修饰靶标序列,由此可以杀死宿主细胞或可以减少宿主细胞群体生长。
13.用于权利要求12的系统中的工程改造的核苷酸序列,其中所述工程改造的序列编码HM-crRNA,用于在宿主细胞中表达所述HM-crRNA,其中各crRNA可与相应的宿主细胞中的Cas3和CASCADECas一起操作,且其中所述工程改造的核酸序列包含
(i)一个或多个重复序列;和
(ii)编码所述HM-crRNA的序列的间隔区序列,其中所述HM-crRNA序列能够与宿主细胞靶标核苷酸序列杂交以将Cas指导至宿主细胞中的靶标序列,其中所述靶标序列在包含AWG或由其组成的PAM的紧邻3’。
14.权利要求12的系统或权利要求13的工程改造的序列,其中所述Cas3包含选自SEQIDNO:287-289、261和263的氨基酸序列或与所述选择的序列具有至少70%同一性的序列。
15.权利要求12至14中任一项的系统或工程改造的序列,其中所述重复序列是选自SEQIDNO:514-731和210-213的重复序列,或与所述选择的序列具有至少70%同一性的序列。
16.权利要求15的系统或工程改造的序列,其中所述重复序列是选自以下的重复序列:
(a)SEQIDNO:210-212和691-695,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌K12菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(b)SEQIDNO:213、677和678,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌O157:H7菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(c)SEQIDNO:514-518,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌042菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(d)SEQIDNO:519-521,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌1303菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(e)SEQIDNO:522-527,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌536菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(f)SEQIDNO:528或529,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌55989菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(g)SEQIDNO:530-532,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌ACN001菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(h)SEQIDNO:533-545,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌APEC菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(i)SEQIDNO:533-537,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌APECIMT5155菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(j)SEQIDNO:538-542,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌APECO1菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(k)SEQIDNO:543-545,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌APECO78菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(l)SEQIDNO:546-560,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌B菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(m)SEQIDNO:556-560,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌BREL606菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(n)SEQIDNO:561-574,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌BL21菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(o)SEQIDNO:575-578,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌BW25113菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(p)SEQIDNO:579-582,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌BW2592菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(q)SEQIDNO:583-588,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌C(例如,ATTC8739)菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(r)SEQIDNO:589-597,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌DH1菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(s)SEQIDNO:598-600,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌E24377A菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(t)SEQIDNO:601-603,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌ECC-1470菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(u)SEQIDNO:604-608,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌ED1a菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(v)SEQIDNO:609-612,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌ER2796菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(w)SEQIDNO:613-618,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌ETEC(例如,H10407)菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(x)SEQIDNO:644-667,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌LF82菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(y)SEQIDNO:668-670,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌LY180菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(z)SEQIDNO:671-673,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌O104:H4菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(aa)SEQIDNO:674-676,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌O111:H(例如,1128)菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(bb)SEQIDNO:679-684,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌P12b菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(cc)SEQIDNO:685,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌PCN033菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(dd)SEQIDNO:686-689,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌PCN061菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(ee)SEQIDNO:690,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌SECECSMS-3-5菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(ff)SEQIDNO:691-695,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌K12MC4100菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(gg)SEQIDNO:696-699,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌UM146菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(hh)SEQIDNO:700-707,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌UMN026菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(ii)SEQIDNO:708-711,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌UMNF18菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(jj)SEQIDNO:712-715,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌UMNK88菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(kk)SEQIDNO:716-720,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌UT189菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(ll)SEQIDNO:721-723,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌VR50菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;
(mm)SEQIDNO:724-729,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌W菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3;或
(nn)SEQIDNO:730或731,任选地其中所述宿主细胞是大肠杆菌Xuzhou21菌株细胞和/或所述Cas3是所述菌株的Cas3。
17.权利要求12至16中任一项的系统或工程改造的序列,其中所述PAM包含AAG、AGG、GAG或ATG或由其组成。
18.用于杀死宿主细胞或减少宿主细胞的生长的HM-CRlSPR/Cas系统,其中所述宿主细胞是链球菌细胞,所述系统包含
(a)用于在宿主细胞中表达HM-crRNA的编码所述HM-crRNA的工程改造的核酸序列,其中各crRNA可与相应的宿主细胞中的Cas3和CASCADECas一起操作,其中所述工程改造的核酸序列包含
(i)一个或多个重复序列,任选地其中所述重复序列是选自SEQIDNO:215-218的重复序列;和
(ii)编码所述HM-crRNA的序列的间隔区序列,其中所述HM-crRNA序列能够与宿主细胞靶标核苷酸序列杂交以将Cas指导至宿主细胞中的靶标序列,其中所述靶标序列在包含NNAGAAW、NGGNG或AW或由其组成的PAM的紧邻3’;
(b)CASCADECas;和
(c)(任选地包含SEQIDNO:265的氨基酸序列)的Cas3,或用于在宿主细胞中表达Cas3的核苷酸序列(任选地包含SEQIDNO:266),或其直向同源物或同源物;
其中表达的HM-crRNA能够在宿主细胞中与CASCADECas和Cas3或所述直向同源物或同源物组合,其中所述Cas3、直向同源物或同源物可与宿主细胞中的所述HM-crRNA一起操作以修饰靶标序列,由此可以杀死宿主细胞或可以减少宿主细胞群体生长。
19.用于权利要求18的系统中的工程改造的核苷酸序列,其中所述工程改造的序列编码HM-crRNA,用于在宿主细胞中表达所述HM-crRNA,其中各crRNA可与相应的宿主细胞中的Cas3和CASCADECas一起操作,其中所...
【专利技术属性】
技术研发人员:J克卢贝,E范德黑尔姆,
申请(专利权)人:斯尼普技术有限公司,
类型:发明
国别省市:英国;GB
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