毒品原植物古柯种属鉴定的微型分子标记开发及应用制造技术

本发明专利技术公开了一组古柯分子鉴定DNA条形码标记引物的开发及应用。本发明专利技术基于古柯近缘植物的叶绿体基因组开发得到用于毒品原植物古柯种属鉴定的微型分子标记，使用设计开发的7对微型分子标记引物可对DNA严重降解的古柯干燥叶片进行鉴定，特异性好、灵敏度高、可靠性强，可应用于毒品原植物古柯非法买卖、走私等案件的物证鉴定，有利于加强毒品原植物犯罪活动的打击。

Development and application of micromolecular markers for identification of coca species

【技术实现步骤摘要】
毒品原植物古柯种属鉴定的微型分子标记开发及应用
本专利技术属于物种鉴定
，具体涉及古柯分子鉴定DNA条形码标记引物的开发及应用。
技术介绍
古柯(Erythroxylumcoca)，原产于秘鲁，是一种热带灌木，其叶含可卡因(古柯碱)。可卡因是古老的麻醉药，是一种细微、雪白的结晶状生物碱。能改变神经膜的渗透性，阻滞神经冲动的传导，导致知觉神经末梢的麻痹和痛觉的消失，产生局部麻醉作用。南美秘鲁及玻利维亚的印地安人常把古柯叶掺入草木灰和石灰石，放入口中咀嚼，以增加耐饥渴的能力，消除疲劳。由于可卡因对中枢神经有较大的毒性，能使大脑皮层兴奋产生欣快感，所以可卡因同样具有易成瘾的特点。剂量增加时可因呼吸抑制而死亡。在毒品非法交易中，可卡因被称为“雪”或“焦碳”。古柯是提取可卡因的原料，所以古柯作为毒品原植物，任何买卖、贸易、走私以及栽培均属违法行为。近年来，毒品原植物古柯的非法走私频有发生，主要通过旅客行李箱夹藏等方式非法携带入境。对于非法携带走私的是否为毒品原植物古柯，除了化学成分分析确认其含有可卡因成分外，其种属认定也是案件定性所必须的。通常非法走私入境的都是古柯的干燥叶片(如图1所示)，此类叶片均经过特殊烘制及干燥，如果形态完整可以通过传统的形态识别进行种属鉴定，但往往犯罪嫌疑人为了增加辨认难度，通常会将叶片粉碎(如图3所示)，形态完全无法进行识别，所以DNA分子鉴定是其种属识别的最佳方法。但是目前植物分子鉴定并没有像动物一样通用的DNA条形码，各植物类群有自己的特殊性，即使是相对而言比较通用的matK、rbcL等分子标记，因其片段长度都大于700bp，对于这种经过烘制的枝叶碎片，其DNA发生大量降解的样本并不适用，往往无法成功扩增出目的片段。这也严重阻碍了其种属的准确鉴别，为毒品原植物走私犯罪的打击带来困扰。
技术实现思路
本专利技术立足DNA条形码分子标记技术在特殊用途植物类群中的研究空白，以古柯近缘植物叶绿体基因组为参照开发毒品原植物古柯种属鉴定的微型分子标记并在案件物证鉴定中应用，旨在为毒品原植物的犯罪打击提供技术支持。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一组古柯分子鉴定DNA条形码，包括matK、rbcL和psbA。上述古柯分子鉴定DNA条形码在古柯样品种属鉴定中的应用。进一步地，所述古柯样品的DNA发生降解。一组用于鉴定上述DNA条形码的引物，所述引物序列如下：EcmatK1-F5'ATCCAAATACCAAACCCG3'(SEQIDNO.1)EcmatK1-R5'CCATTAGTAACTCGTCCC3'(SEQIDNO.2)EcmatK2-F5'GGACGAGTTACTAATGGG3'(SEQIDNO.3)EcmatK2-R5'AAGGATACGCTTCTTCTG3'(SEQIDNO.4)EcmatK3-F5'GTACCGCCGAAGGATTTT3'(SEQIDNO.5)EcmatK3-R5'TTTTCTCCGTAACCAAGC3'(SEQIDNO.6)EcmatK4-F5'TCAAGAAGGAACCGAGAA3'(SEQIDNO.7)EcmatK4-R5'ACGGGTCAGAAAGAGTAAAA3'(SEQIDNO.8)EcrbcL1-F5'CCCAACAGAAACTAAAGC3'(SEQIDNO.9)EcrbcL1-R5'ATTACCCACAATCGAAGT3'(SEQIDNO.10)EcrbcL2-F5'TACGTCTGGAGGATTTGC3'(SEQIDNO.11)EcrbcL2-R5'AATGCCCTTTGATTTCAC3'(SEQIDNO.12)EcpsbA-F5'GGGCTCCCTCTACAAATG3'(SEQIDNO.13)EcpsbA-F5'CTACTTCCGCCCCTAATA3'(SEQIDNO.14)。上述引物在古柯样品种属鉴定中的应用。进一步地，所述古柯样品的DNA发生降解。一种DNA发生降解的古柯样品种属鉴定方法，包括以下步骤：步骤1，从待测样品中提取DNA序列；步骤2，以步骤1的DNA序列作为模板，采用上述引物组对其进行PCR扩增，扩增产物进行sanger双向测序；步骤3，对matK基因的4个微型片段EcmatK1、EcmatK2、EcmatK3、EcmatK4进行拼接，对rbcL基因的2个微型片段EcrbcL1、EcrbcL2进行拼接，获得完整序列，用获得的EcmatK、EcrbcL、EcpsbA完整序列片段进行blast同源比对，鉴定样品种属。PCR反应体系为：总体积为25μL，含有PremixTaq聚合酶12.5μL，模板DNA4μL(10ng/μL)，上下游引物各1μL，ddH2O6.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环；72℃延伸10min。本专利技术基于古柯属植物叶绿体基因组开发得到的用于毒品原植物古柯种属鉴定的微型分子标记，根据DNA条形码开发设计的7对微型分子标记引物可对DNA严重降解的古柯干燥叶片进行鉴定。有益效果：1、本专利技术基于古柯近缘植物叶绿体基因组开发特殊植物类群毒品原植物古柯的种属鉴定微型分子标记，特异性好、灵敏度高、可靠性强。2、本专利技术开发的微型分子标记适用于DNA严重降解的古柯干燥叶片，检出率高达86％，进一步提升了古柯分子鉴定的成功率。3、本专利技术开发的微型分子标记可应用于毒品原植物古柯非法买卖、走私等案件的物证鉴定，有利于加强毒品原植物犯罪活动的打击。附图说明图1为案件中常见非法走私的古柯叶片形态图。图2为实施例1中7个微型分子标记的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图3为实施2中采用的某案件中非法携带入境的23份古柯检材样本图。图4为实施2中23份古柯基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图(示DNA降解)。图5为实施2中23份古柯微型分子标记EcmatK1扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图6为实施2中23份古柯微型分子标记EcmatK2扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图7为实施2中23份古柯微型分子标记EcmatK3扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图8为实施2中23份古柯微型分子标记EcmatK4扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图9为实施2中23份古柯微型分子标记EcrbcL1扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图10为实施2中23份古柯微型分子标记EcrbcL2扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图11为实施2中23份古柯微型分子标记EcpsbA扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。在上述电泳图中，Marker由下至上条带依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组古柯分子鉴定DNA条形码，其特征在于：包括mat K、rbc L和psb A。/n

【技术特征摘要】
1.一组古柯分子鉴定DNA条形码，其特征在于：包括matK、rbcL和psbA。


2.权利要求1所述的DNA条形码在古柯样品种属鉴定中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述古柯样品的DNA发生降解。


4.一组用于鉴定上述DNA条形码的引物，其特征在于：所述引物序列如下：
EcmatK1-F5'ATCCAAATACCAAACCCG3'
EcmatK1-R5'CCATTAGTAACTCGTCCC3'
EcmatK2-F5'GGACGAGTTACTAATGGG3'
EcmatK2-R5'AAGGATACGCTTCTTCTG3'
EcmatK3-F5'GTACCGCCGAAGGATTTT3'
EcmatK3-R5'TTTTCTCCGTAACCAAGC3'
EcmatK4-F5'TCAAGAAGGAACCGAGAA3'
EcmatK4-R5'ACGGGTCAGAAAGAGTAAAA3'
EcrbcL1-F5'CCCAACAGAAACTAAAGC3'
EcrbcL1-R5'ATTAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈云霞，薛晓明，南程慧，黄娅琳，蒋敬，郭海涛，吉小林，
申请(专利权)人：南京森林警察学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32