本发明专利技术公开了鞍带石斑鱼胰岛素样因子INSL‑3基因、编码蛋白及其应用。胰岛素样因子INSL‑3基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术从鞍带石斑鱼的cDNA中克隆得到了胰岛素样因子INSL‑3基因，该胰岛素样因子INSL‑3基因能够促进精母细胞产生和/或促进鞍带石斑鱼转雄，因此可以获得功能性的雄性亲鱼，为鞍带石斑鱼人工繁育工作顺利进行提供了条件。
Insulin like factor insl-3 gene, coding protein and its application in Epinephelus sellaris
【技术实现步骤摘要】
鞍带石斑鱼胰岛素样因子INSL-3基因、编码蛋白及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及鞍带石斑鱼胰岛素样肽INSL-3基因、编码蛋白及其应用。
技术介绍
胰岛素样因子3(INSL3)最初被鉴定为在睾丸的支持(Leydig)细胞中高度表达的新基因，并且最初被命名为Leydig胰岛素样肽(Ley-IL)；它同时由于与肽激素松弛素的同源性也导致了松弛素样因子的名称(RLF)；然而，INSL3现在是它的通用名称，并且已知它是松弛素肽家族的成员。INSL3最早由公猪睾丸克隆所得，从那时起，其cDNA被广泛的从哺乳动物的睾丸和其他组织中克隆所得，包括人、绒猴、牛、绵羊、小鼠、大鼠、狗、鹿和山羊；除了哺乳动物外，其cDNA也在三种不同的鲨鱼和鸟的睾丸中克隆得到；同时也确定insl3基因存在于硬骨鱼中，2009年在斑马鱼的Leydig细胞中克隆得到。目前认为，INSL3可以作为Leydig细胞的标记基因。在斑马鱼的研究中发现，INSL3能刺激成年斑马鱼精原细胞分化和精子的形成；并且也参与Leydig细胞分化。鞍带石斑鱼因其味道鲜美、营养丰富而广受欢迎，是一种具有很高经济价值的食用鱼类。鞍带石斑鱼是典型的雌雄同体鱼类，生殖过程中要经历雌性过程后，再转变为雄性，生殖周期很长，获得雄性一般都需要6年以上，在进行人工繁殖时，雄性亲鱼非常稀缺。而且由于环境的破坏和过渡捕捞，在自然海域中捕捞到野生雄性亲鱼机会更加渺茫。因此，如何获得功能性的雄性亲鱼成为鞍带石斑鱼人工繁育工作能否顺利进行的关键。所以对于研究其生殖机制是很有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种胰岛素样因子INSL-3基因、编码蛋白及应用。本专利技术的第一个目的是提供胰岛素样因子INSL-3基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。共124个氨基酸，分子量为13.9千道尔顿。本专利技术的第二个目的是提供上述胰岛素样因子INSL-3基因的编码蛋白的编码基因。优选，所述的胰岛素样因子INSL-3基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第三个目的是提供胰岛素样因子INSL-3基因在制备促进精母细胞产生和/或促进鞍带石斑鱼转雄的药物中的应用。即在制备获得功能性的雄性鞍带石斑鱼中的应用。本专利技术从鞍带石斑鱼的cDNA中克隆得到了胰岛素样因子INSL-3基因，该胰岛素样因子INSL-3基因能够促进精母细胞产生和/或促进鞍带石斑鱼转雄，因此可以获得功能性的雄性亲鱼，为鞍带石斑鱼人工繁育工作顺利进行提供了条件。附图说明：图1是INSL-3基因mRNA在斜带石斑鱼精巢中原位杂交图，左边小图是正义探针杂交图；图2是INSL-3基因过表达质粒注射45天后性腺组织学切片分析，SC:精母细胞；O：卵母细胞。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：鞍带石斑鱼INSL-3基因cDNA全序列的克隆根据鞍带石斑鱼转录组数据库中的信息，在开放读码框拼接序列两端设计特异引物，上游引物F序列(具体为5’-ATGTCTGCTGTGAAGTGTCT-3’)，下游引物R序列(具体为5’-CTAGCAAAACTGGATCAACT-3’)。提取鞍带石斑鱼的总RNA，然后逆转录获得第一链cDNA，以第一链cDNA为模板，以上游引物F和下游引物R为引物进行PCR扩增，扩增片段大小为375bp，电泳分离DNA片段，切胶回收目的产物，将纯化后的目的产物连接至pGEM-T载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序，BLAST同源性分析表明，目的产物确为INSL-3基因的cDNA序列片段，由此获得的鞍带石斑鱼INSL-3基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，具体为：5'-ATGTCTGCTGTGAAGTGTCTGGTGTCTCTGATGGTGGTGCTGGTGGCTGCAGTGTGTGTGGTTCATGCACAGGAGAGGATTAAGATGTGTGGGAGAGAGCTGATACGTCTGGCCGTCTCGTCCTGCGGTAACTCTCGGCTGAGGAGAAGCATCCCGGACGTGGAACTGGGGCAGTACACCTCTCACTGGGACCAGGACGCCTCCACAGAGGAGCACCAGGCTATGGAGATGGTCCACGTCCCTCAAGAGGATGTTGTATCGCTGGCTCCTCACTGGTACCCCTTGTCCTCCCGGATGAGACGTGCTGCTGGGAAAATATCTGATATTTGTTGTCAGGAAGGATGCAGCATGAAAGAGTTGATCCAGTTTTGCTAG-3'对应的编码的氨基酸序列如下：MSAVKCLVSLMVVLVAAVCVVHAQERIKMCGRELIRLAVSSCGNSRLRRSIPDVELGQYTSHWDQDASTEEHQAMEMVHVPQEDVVSLAPHWYPLSSRMRRAAGKISDICCQEGCSMKELIQFC。共124个氨基酸，分子量为13.9千道尔顿。实施例2：鞍带石斑鱼INSL-3基因精巢组织原位杂交(1)质粒提取无内毒素提取实施例1中含有鞍带石斑鱼INSL-3基因的pGEM-T载体的DH5α大肠杆菌的质粒(即含有鞍带石斑鱼INSL-3基因片段的pGEM-T载体)。(2)片段线性化将质粒片段单酶切，在T7和SP6端各选取一个酶切位点，将片段线性化后进行纯化；酶切体系如下：(3)体外转录及RNA纯化参考DIGRNALabelingKit(SP6/T7)(Roche，美国)说明书。①在冰上配置以下体系，在PCR仪上37℃反应2h；②加入2μLDNaseI，在PCR仪上37℃反应15min后加入2μLEDTA终止反应。③向上述体系中加入75μL预冷的无水乙醇和2.5μLLiCl，-80℃放置30min；④取出，转移到1.5mL离心管中，4℃，12000rpm，离心15min，弃上清；⑤加入50μL预冷的DEPC水配置的70％乙醇，4℃，12000rpm，离心5min，清洗RNA；⑥弃上清，待乙醇挥发2min后加入50μLDEPC水和1μLRNaseinhibitor；⑦测浓度和电泳检测，剩余探针分装并放入-80℃冰箱备用。(4)原位杂交第一天：杂交(所有试剂均使用DEPC水配置)①室温用1×PBS浸泡，10min×2；②室温用DEPC水浸泡，5min；③室温条件用0.2MHCl浸泡，10min；0.2MHCl：40mL1×PBS+200μL40％HCl④室温用1×PBS浸泡，5min×2；⑤37℃用1μg/mL蛋白酶K浸泡15min；1μg/mL蛋白酶K：50mL1×PBS+2.5μL蛋白酶K(20μg/mL)⑥室温用1×PBS本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.胰岛素样因子INSL-3基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n
【技术特征摘要】
1.胰岛素样因子INSL-3基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.编码权利要求1所述的胰岛素样因子INSL-3基因的编码蛋白的胰岛素样因子INSL-3基因。
3.根据权利要求2所述的胰岛素样因子INSL-3基因，其特征在于，所述的胰岛素样因子...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙凯辉，洪宇聪，张勇，王晓珊，范衡珊，赵书燕，
申请(专利权)人：广东越群海洋生物研究开发有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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